Иммуномодуляторный метаболит-влак — шеҥгел микросредын (ТМЭ) тӱҥ ойыртемже, но икмыняр исключений деч посна нунын идентичностьышт шукыж годым палыдыме кодеш. Тыште ме кӱкшӧ степенян серозный карцинома (HGSC) дене черланыше-влакын шешкым да асцит гыч шешкым да Т-клетке-влакым лончылена, тыгай тӱрлӧ ТМЭ отделений-влакын метаболомыштым почын пуаш манын. Асцит ден шешке клетке-влакын метаболит ойыртемышт кумда. Асцит дене таҥастарымаште, шешкым шыҥдарыше Т-клетке-влак 1-метилникотинамид (МНА) дене ятырлан пойдаралтыныт. Т-клеткыште МНК кӱкшытшӧ кӱзен гынат, никотинамид N-метилтрансферазын (S-аденозилметионин гыч никотинамидыш метил группо-влакым кусарыме фермент) экспрессийже фибробласт ден шешкым клетке-влак дене гына чак кылдалтын. Функционально, МНА Т-клетке-влакым секретироватлаш таратен, шешкым кумылаҥдыше цитокин шешкым некроз фактор альфа. Сандене, ТМЭ-производный МНА Т-клетке-влакын иммунный регулироватлымашыштлан полша да айдеме ракым эмлыме годым иммунотерапий цельым ончыкта.
Шинча гыч лекше метаболит-влак антишижевой иммунитетлан кугу тормозной эффектым ыштен кертыт, да утларак да утларак доказательстве ончыкта, нуно тыгак чер вияҥме тӱҥ движущий вий семын служитлен кертыт (1). Варбург эффект деч посна, пытартыш жапыште пашам ышташ тӱҥалыныт, шешке клетке-влакын метаболический состоянийыштым да тудын шешке микросредын (ТМЭ) иммунный состоянийже дене кылым палемдаш тӱҥалыныт. Чыве модель да айдеме Т-клетке-влак дене шымлымаш ончыктен: глутамин метаболизм (2), оксидативный метаболизм (3) да глюкоза метаболизм (4) тӱрлӧ иммунный клетке подгруппо-влаклан посна ыштен кертыт. Тиде корнылаште икмыняр метаболит Т-клетке-влакын противоопухолевый функцийыштым тормозитлат. Доказатлыме, мом блокадыште кофермент тетрагидробиоптерин (BH4) Т-клетке-влакын пролиферацийыштлан эҥгекым ыштен кертеш, да организмыште BH4 кугеммаш CD4 да CD8 дене медиировать противоопухолевый иммунный вашмутым кугемден кертеш. Тылеч посна, кинуренин иммуносупрессивный эффектым BH4 (5) пуымо дене утарен кертеш. Изоцитратдегидрогеназа (IDH) мутант глиобластома годым энантиометаболический (R)-2-гидроксиглутарат (R-2-HG) секретироватлымаш Т-клетке-влакын активацийыштым, пролиферацийыштым да цитолиз активностьыштым тормозитла (6). Шукерте огыл ончыктеныт, метилглиоксал, гликолизын субпродуктшо, миелоидный лектышан супрессор клетке-влак дене лектеш, а метилглиоксалын Т-клетке кусарымыже эффектор Т-клетке-влакын пашаштым тормозитлен кертеш. Эмлыме годым метилглиоксалын нейтрализацийже миелоид гыч лекше супрессор клетке-влакын (МДСК) пашаштым сеҥен кертеш да чыве модельыште контрольный пункт блокадный терапийым синергетически кугемда (7). Тиде шымлымаш-влак пырля ТМЭ-влак деч лекше метаболит-влакын Т-клетке-влакын пашаштым да пашаштым регулироватлымаште тӱҥ рольыштым палемдат.
Т-клетке-влакын дисфункцийышт нерген кумдан палыме рак овариум (8). Тиде ужаш дене кылдалтын, молан манаш гын, метаболический характеристикым шкешотан гипоксий да аномальный шешке сосудистый (9), тидын лектышыш шуаш манын, глюкоза да триптофан субпродукт, кузе тыгай шӧр кислота да кинуренин. Уто внеклеточный лактат интерферон-γ (IFN-γ) ыштен лукмашым иземда да миелосупрессивный подгруппо-влакын дифференциацийыштым виктарен шога (10, 11). Триптофан кучылтмаш Т-клетке-влакын пролиферацийыштым тура тормозитла да Т-клетке рецептор-влакын сигнализацийыштым тормозитла (12-14). Тиде эскерымаш-влак гынат, иммунный метаболизм йыр шуко пашам in vitro Т-клетке культурышто оптимизироватлыме средам кучылтын эртареныт, але in vivo гомологический чыве модель дене гына чактареныт, нунын кокла гыч иктыжат айдеме ракын да Физиологический макро- да микро средан гетерогенностьшым тичмашнек ок ончыкто.
Оварий ракын тыглай ойыртемже — перитонеальный шарлыме да асцитын лекмыже. Асцитыште клетке вӱд погынымаш чер ончылно да начар прогноз дене кылдалтын (15). Отчет почеш, тиде шкешотан отделенийыште гипоксический, кугу кӱкшытыштӧ сосудистый эндотелий кушмаш фактор (VEGF) да индоламин 2,3-диоксигеназа (IDO), да Т-регуляторный клетке да миелоид тормозящий клетке-влак дене инфильтрация (15-18). Асцитын метаболический средаже шешкын шкеж деч ойыртемалт кертеш, сандене перитонеальный пространствыште Т-клетке-влакын перепрограммироватлымашышт раш огыл. Тылеч посна, асцит ден метаболит-влак коклаште тӱҥ ойыртем да гетерогенность, шешке средаште улшо, иммунный клетке-влакын инфильтрацийыштым да нунын шешке ӱмбалне функцийыштым локтыл кертеш, да умбакыже шымлымаш кӱлеш.
Тиде проблемым решатлаш манын, ме тӱрлӧ клетке типым (CD4 + да CD8 + Т-клетке-влакым пуртымо) тыгак шешкым кӧргыштӧ да коклаште шымлаш шижтарен клетке-влакым ойырен да жидкостный хроматографий тандемный масс-спектрометрий (LC-MS/MS) йӧн дене пайдаланена. Тудын метаболитше-влак пациентын икгай асцит да шешкым ыштыме средаштыже клетке-влакым авалтат. Тиде йӧн дене ме кугу мер йогын цитометрий да ик клетке РНК-секвенирование (scRNA-seq) дене пырля пайдаланена, тыге тиде тӱҥ популяций-влакын метаболический состоянийыштым раш рашемдыме портретым пуаш лиеш. Тиде йӧн шешке Т-клеткыште 1-метилникотинамидын (МНА) кӱкшытшӧ ятырлан кугеммым ончыктен, а in vitro эксперимент-влак ончыктеныт: МНА-н Т-клетке-влакын пашаштлан иммуномодулирующий эффектыже ончыч палыдыме лийын. Тӱҥ шотышто, тиде йӧн шешкым да иммунный клетке-влак коклаште ваш-ваш метаболический вашкыл-влакым почын пуа, да иммунный регулироватлымаш метаболит-влак нерген шкешотан шинчымашым пуа, тидыже Т-клетке негызеш рак овариум иммунотерапийым эмлыме годым пайдале лийын кертеш Эмлыме йӧн-влак.
Ме кугу мер йогын цитометрийым кучылтын, ик жапыште глюкозым налмашым шотлен луктынна [2-(N-(7-нитрофенил-2-окса-1,3-диаза-4-ил)амино)-2-дезоксиглюкоза (2-NBDG) да митохондриальный активность [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (MT DR, 2017) велыште улыт типичный маркер-влак, иммунный клетке-влакым да шешкым клетке-влакын популяцийыштым ойырышо (S2 таблице да S1A рис). Тиде анализ ончыктен: Т-клетке-влак дене таҥастарымаште, асцит ден шеҥгел клетке-влакын глюкозым налме кӱкшытышт кугурак, но митохондриальный пашаште ойыртемышт изирак. Кокла шот дене глюкоза поглощение шешке клетке-влак [CD45-EpCAM (EpCAM)+] кум-ныл пачаш Т-клетке-влак деч, да кокла шот дене глюкоза поглощение CD4 + Т-клетке-влак деч 1,2 пачаш CD8 + Т-клетке-влак, мом ончыкта, Шинча инфильтраций лимфоцит-влак (TIL) тӱрлӧ метаболический йодмаш-влак улыт, кеч икгай рис TAME (рис 1). Вашталтышлан, шеҥгел клеткылаште митохондриальный активность CD4 + Т-клетке-влак дене икгай, а кок типлан клетке-влакын митохондриальный активностьышт CD8 + Т-клетке-влак деч кугурак (рис. 1В). Тӱҥ шотышто, тиде лектыш метаболический кӱкшытым ончыкта. Шинча клетке-влакын метаболический активностьышт CD4 + Т-клетке-влак деч кугурак, а CD4 + Т-клетке-влакын метаболический активностьышт CD8 + Т-клетке-влак деч кугурак. Клетке тип-влак коклаште тыгай эффектым ончыде, CD4 + да CD8 + Т-клетке-влакын метаболический состоянийыштышт але нунын асцитыште относительный ужашыштышт шешкым дене таҥастарымаште нимогай ойыртем уке (рис. 1С). Вашталтыш дене таҥастарымаште, CD45-клетке фракцийыште, асцит дене таҥастарымаште, шеҥгелне EpCAM+ клетке-влакын ужашышт кугемын (рис. 1D). Ме тыгак EpCAM+ да EpCAM- клетке компонент-влак коклаште раш метаболический ойыртемым эскеренна. EpCAM+ (шешке) клетке-влак EpCAM- клетке-влак деч глюкозым утларак налыт да митохондриальный активностьым налыт, тидыже ТМЭ-ште шешке клеткылаште фибробласт-влакын метаболический активностьышт деч ятырлан кугурак (1-ше рис, Е да F).
(А да В) Медиана флуоресценция интенсивность (МФИ) глюкоза поглощение (2-NBDG) (А) да митохондриальный активность CD4 + Т-клетке-влак (MitoTracker пычкемыш ужар) (В) Представитель график-влак (шолаште) да таблице дене ончыктымо данный-влак (Пурлаште), CD8 + Т-клетке-влак да EpCAM + CD45-тумор клетке-влак да шешке гыч клетке-влак семын. (C) Асцит ден шешкым CD4 + да CD8 + клетке-влакын (CD3 + Т-клетке-влакын) отношенийышт. (D) Асцитыште да шешкеште (CD45−) EpCAM + шешке клетке-влакын ужашышт. (Е да F) EpCAM + CD45-шишке да EpCAM-CD45-матрице глюкоза поглощение (2-NBDG) (Е) да митохондриальный активность (MitoTracker пычкемыш ужар) (F) представительный график-влак (шолаште) да таблице данный ( Пурлаште) Асцит да шешкым клетке-влак. (G) CD25, CD137 да PD1 экспрессийын йогын цитометрий дене ончыктымо графикше-влак. (H да I) CD25, CD137 да PD1 экспрессий CD4 + Т-клеткыште (H) да CD8 + Т-клеткыште (I). (J да K) CCR7 ден CD45RO экспрессий негызеш наивный, рӱдӧ шарнымаш (Tcm), эффектор (Teff) да эффектор шарнымаш (Tem) фенотип-влак. Асцит ден шешкым CD4 + Т-клетке-влакын (J) да CD8 + Т-клетке-влакын (K) представительный сӱретышт (шолаште) да таблице данный-влак (пурлаште). Р значений-влакым парный t-тест дене рашемдыме (*Р<0,05, **Р<0,01 да ***Р<0,001). Линий келшыше пациент-влакым ончыкта (n = 6). ФМО, флуоресценций минус ик; МФИ, медианный флуоресценция интенсивность.
Умбакыже лончылымаш кӱкшӧ рашемдыме Т-клетке фенотипический статус коклаште моло кӱлешан ойыртемым пален налын. Активированный (рис. 1, G гыч I марте) да эффектор шарнымаш (рис. 1, J да K) шешкым асцит деч (CD3 + Т-клетке-влакын ужашышт) ятырлан чӱчкыдынрак вашлиялтыт. Тыгак, активация маркер-влакын (CD25 да CD137) да пытарыме маркер-влакын [программлыме клетке колымаш белок 1 (PD1)] экспрессийышт дене фенотипым лончылымаш ончыктен: нине популяций-влакын метаболический характеристикышт тӱрлӧ гынат (рис. S1, B гыч E марте) , Но шарнымаш, але шарнымаш подмножество подмножество коклаште нимогай значениян метаболический ойыртем эреак эскерен огыл (рис. S1). И). Тиде лектышым пеҥгыдемденыт, машина тунемме йӧн дене пайдаланен, клетке фенотип-влакым автоматически ойырен (21), умбакыже пациентын асцитыштыже коя мӱшкыр клетке-влакын кугу чотышт (CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO +) улмым пален налын (рис. S2A ). Чыла палемдыме клетке тип кокла гыч тиде миелоидный клетке популяций эн кугу глюкоза поглощенийым да митохондриальный активностьым ончыктен (рис. S2, B гыч G марте). Тиде лектыш-влак HGSC пациент-влакын асцитыште да шешкым мумо шуко клетке тип коклаште виян метаболический ойыртемым ончыктат.
ТИЛ-ын метабономический характеристикыжым умылаш тӱҥ нелылык — шешкым ситыше арулык, качестве да чот Т-клетке образец-влакым ойырен налаш кӱлмӧ. Пытартыш жапыште эртарыме шымлымаш ончыктен: йогын цитометрий негызеш сортироватлыме да шарикым пойдарыме йӧн-влак клетке метаболит профильыште вашталтышым конден кертыт (22-24). Тиде проблемым сеҥаш манын, ме LC-MS/MS дене лончылымаш деч ончыч хирургий йӧн дене лукмо айдеме рак гыч ТИЛ-ым ойырен да ойырен налме шергаш пойдарымаш йӧн дене оптимизацийым ыштенна (Материал ден йӧн-влакым ончо; 2А рис.). Тиде протоколын метаболит вашталтышлан чумыр влиянийжым аклаш манын, ме ӱлнӧ ончыктымо шергаш ойырен налме ошкыл деч вара таза донор-влакын активироватлыме Т-клетке-влакын метаболит профильыштым шергаш ойырен огыл, а лум ӱмбалне кодшо клетке-влак дене таҥастаренна. Тиде качествым тергыме анализ ончыктен: нине кок условий коклаште кугу кыл уло (r = 0,77), да 86 метаболит тӱшкан технический повторяемостьшо кугу повторяемость уло (рис. 2В). Сандене, тиде йӧн-влак клетке тип пойдарымашым эртыше клеткылаште чын метаболит анализым ыштен кертыт, тыге HGSC-ште ойыртемалтше метаболит-влакым палемдаш икымше кӱкшӧ разрешениян платформым пуат, тыге еҥ-влаклан клетке специфичностьым келгынрак умылаш йӧным пуат.
(А) Магнит шарик пойдарымашын схемыже. ЖК-МС/МС дене лончылымаш деч ончыч клетке-влак магнит шарик дене пойдаралтме кум гана радамлын эртат але лум ӱмбалне кодыт. (B) Метаболит-влакын шуко улмыштлан пойдарымаш типын влиянийже. Кажне пойдарымаш типлан кум висымашын кокла шотшо ± SE. Сер линий 1:1 кылым ончыкта. Класс кӧргысӧ корреляций (ICC) угыч висымаште ончыктымо осевый этикеткыште. НАД, никотинамид аденин динуклеотид. (C) Пациент метаболит анализ паша радамын схемыже. Асцит але шешкым пациент деч погат да криоконсервироватлат. Кажне образецын изи ужашыжым проточный цитометрий дене лончыленыт, а моло образец-влакым CD4+, CD8+ да CD45- клетке-влаклан кум тур пойдарымашым эртеныт. Тиде клетке фракций-влакым LC-MS/MS йӧн дене лончыленыт. (D) Стандартизироватлыме метаболит шуко улмо шокшо картыште. Дендрограмме образец-влак коклаште евклидовский торалык-влакым Уордын чумырен шогымыжым ончыкта. (Е) Тӱҥ компонент анализ (ТКА) образец метаболит картыште, кажне образецын кум репликыжым ончыкта, ик пациент гыч образец-влак линий дене ушеныт. (F) пациентлан келыштарыме образецын метаболит профильжын ПКА-же (т.е. ужаш избыточностьым кучылтын); образец тип выпуклый корпус дене чеклалтеш. PC1, тӱҥ компонент 1; ПК2, тӱҥ компонент 2.
Умбакыже ме тиде пойдарымаш йӧн дене 99 метаболитым CD4 +, CD8 + да CD45-клетке фракцийлаште шым HGSC пациентын тӱҥ асцитыштыже да шешкыштышт лончылаш кучылтынна (рис. 2С, рис. S3A да таблице S3 да S4). Кӱлешан популяций илыше клетке-влакын тӱҥалтыш кугу образецышт гыч 2% гыч 70% марте шотлалтеш, да клетке-влакын ужашышт пациент-влак коклаште чот ойыртемалтеш. Шар-влакым ойырен налме деч вара, пойдаралтше интересым ужаш (CD4+, CD8+ але CD45-) образецыште кокла шот дене чыла илыше клетке-влак кокла гыч 85% утла шотлалтеш. Тиде пойдарымаш йӧн айдеме шешке тканьын метаболизмже гыч клетке популяцийым лончылаш йӧным пуа, кудым кугу образец гыч ышташ ок лий. Тиде протоколым кучылтын, ме рашемдышна, l-кинуренин ден аденозин, тиде кок сайын палемдыме иммуносупрессивный метаболит-влак шешкым Т-клеткыште але шешкым клеткыште нӧлталтше лийыныт (рис. S3, B да C). Сандене тиде лектыш-влак мемнан клетке-влакым ойырен налме да масс-спектрометрий технологийын пациент тканьыште биологически кӱлешан метаболит-влакым муаш ӱшанле улмыштым да кертмыштым ончыктат.
Мемнан анализна тыгак пациент-влак коклаште да нунын коклаште клетке тип-влакын виян метаболический ойыртемыштым ончыктен (рис. 2D да рис. S4A). В частности, моло пациент дене таҥастарымаште, 70 пациент тӱрлӧ метаболический характеристикым ончыктен (рис 2Е да рис S4B), пациент-влак коклаште кугу метаболический гетерогенность лийын кертеш манын ончыкта. Палемдыман, моло пациент дене таҥастарымаште (1,2 гыч 2 литр марте; S1 таблице), 70-ше пациентыште (80 мл) погымо асцитын чумыр кугытшо шагалрак лийын. Тӱҥ компонент анализ годым пациент-влак кокласе гетерогенностьым контрольышто кучымаш (мутлан, ужаш избыточность анализ дене пайдаланыме) клетке тип коклаште вашталтышым ончыкта, а клетке тип да/але микросреда метаболит профиль почеш раш чумыргеныт (2F рис.). Ик метаболит-влакым лончылымаш тыгай эффектым палемден да клетке тип ден микросреда коклаште кугу ойыртемым пален налын. Палемдыман, эн экстремальный ойыртем эскерен МНА, тудо мӧҥгешла, CD45- клеткыште да CD4+ да CD8+ клеткыште пойдаралтын, нуно шешкым шыҥдарат (рис. 3А). CD4 + клеткылаште тиде эффект эн раш коеш, да CD8 + клеткылаште МНА тыгак йырым-йырысе среда дене чот кылдалтын. Туге гынат, тиде кӱлешан огыл, вет шым пациент гыч кумытшо гына шешке CD8+ баллым аклаш лиеш. МНА деч посна, асцит ден шешкылаште тӱрлӧ типлан клеткыште, ТИЛ-ыште начарын палемдыме моло метаболит-влакат дифференциально поян улыт (рис. S3 да S4). Сандене тиде данный-влак умбакыже шымлымашлан иммуномодулирующий метаболит-влакын перспективный наборыштым почын пуат.
(А) Асцит да шешкым гыч CD4+, CD8+ да CD45- клеткылаште МНА-н нормализоватлыме содержанийже. Коробкаште диаграмме медианым (линий), межквартальный диапазоным (рамым шарнир) да данный диапазоным ончыкта, межквартальный диапазон деч 1,5 пачаш марте (рамым ӱпшӧ). Пациент материалым да йӧн-влакым ончыктымо семын, пациентын лимма значенийжым кучылтын, Р значенийым рашемдаш (*Р<0,05 да **Р<0,01). (B) МНА метаболизмын схемыже (60). Метаболит-влак: S-аденозил-1-метионин; SAH, S-аденозин-1-гомоцистеин; НА, никотинамид; МНА, 1-метилникотинамид; 2-ПЙ, 1-метил- 2-пиридон-5-карбоксамид; 4-ПЙ, 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид; NR, никотинамид рибоза; НМН, никотинамид мононуклеотид. Фермент-влак (шем): ННМТ, никотинамид N-метилтрансфераза; СИРТ, сиртуин-влак; NAMPT, никотинамид фосфорибозил трансфераза; AOX1, альдегид оксидаза 1; НРК, никотинамид рибозид киназа; НМНАТ, никотинамид моно Нуклеотид аденилат трансфераза; Pnp1, пурин нуклеозид фосфорилаза. (C) t-SNE scRNA-seq асцит (шем) да шешкым (ужар; n = 3 пациент). (D) scRNA-seq дене палемдыме тӱрлӧ клетке популяцийыште NNMT экспрессий. (Е) SK-OV-3, айдеме эмбриональный почко (HEK) 293T, Т-клеткыште да МНА дене обрабатыватлыме Т-клеткыште NNMT ден AOX1 экспрессий. SK-OV-3 дене таҥастарымаште йыгырмут выраженийым ончыктымо. SEM дене экспрессий образец ончыкталтеш (n = 6 таза донор). Ct значенийже 35 деч кугурак гын, рашемдыме огыллан шотлалтеш (UD). (F) SLC22A1 да SLC22A2 SK-OV-3, HEK293T, Т-клеткыште да 8мМ МНА дене обрабатыватлыме Т-клеткыште экспрессий. SK-OV-3 дене таҥастарымаште йыгырмут выраженийым ончыктымо. SEM дене экспрессий образец ончыкталтеш (n = 6 таза донор). Ct значенийже 35 деч кугурак гын, рашемдыме огыллан шотлалтеш (UD). (G) МНА дене 72 шагат инкубаций деч вара активированный таза донор Т-клеткыште клетке МНА содержаний. SEM дене экспрессий образец ончыкталтеш (n = 4 таза донор).
МНА метил группым S-аденозил-1-метионин (SAM) гыч никотинамид (NA) никотинамид N-метилтрансфераза (NNMT; рис. 3В) дене кусарыме дене ышталтын. ННМТ тӱрлӧ айдеме ракыште утларак экспрессироватлалтеш да пролифераций, инвазий да метастаз дене кылдалтын (25-27). ТМЭ-ште Т-клеткыште МНА-н источникшым сайынрак умылаш манын, ме scRNA-seq-ым кучылтынна, кум HGSC пациентын асцитыштыже да шешкыштыже клетке тип-влак коклаште NNMT-н экспрессийжым палемдаш манын (S5 табл.). Иктаж 6500 клеткым лончылымаш ончыктен: асцит да шешкым ыштыме средаште ННМТ-н экспрессийже фибробласт ден шешкым клетке-влакын популяцийышт дене гына чак кылдалтын (3-шо рис., С да D). Палемдыман, PTPRC (CD45 +) экспрессийым ончыктышо кеч-могай популяцийыште раш NNMT экспрессий уке (рис. 3D да рис. S5A), тидыже метаболит спектрыште палемдыме МНА-м Т-клеткыш пуртымо нерген ончыкта. Альдегид оксидаза 1 (AOX1) экспрессий МНА-м 1-метил-2-пиридон-5-карбоксамид (2-PYR) але 1-метил-4-пиридон-5-карбоксамид (4- PYR) савыра; Рисункыште 3В) тыгак COL1A1 экспрессироватлыше фибробласт-влакын популяцийышт дене гына чак кылдалтын (рис. S5A), нуно пырля ончыктат, Т-клетке-влакын тыглай МНК метаболизмын вийышт уке. Тиде МНА дене кылдалтше ген-влакын экспрессий образецыштым HGSC пациент-влакын асцитышт гыч кокымшо посна клетке данный наборым кучылтын тергеныт (рис. S5B; n = 6) (16). Тылеч посна, количественный полимеразный шинчыр реакций (qPCR) анализ таза донор Т-клетке-влак дене эмлыме МНА ончыктен, контроль дене таҥастарымаште SK-OV-3 овуляция шешкым клетке-влак, NNMT але AOX1 почти лийын огыл (рис 3Е). Тиде вучыдымо лектыш ончыкта, молан манаш гын, МНА фибробласт але шешкым гыч ТМЭ-ште воктенысе Т-клеткылашке секретироватлалт кертеш.
Кандидат-влак 1 гыч 3 марте органике катион транспортер-влакын ешыштым (OCT1, OCT2 да OCT3) пуртат гынат, нуным растворимый носитель 22 (SLC22) еш (SLC22A1, SLC22A2 да SLC22A3) коден, МНА-н потенциальный транспортерже-влак эше рашемдыме огытыл (28) . Таза донор Т-клетке гыч мРНК-н QPCR-же SLC22A1-ын изи экспрессий кӱкшытшӧ, но SLC22A2-ын палыдыме кӱкшытшӧ улмыжым ончыктен, тидыже литературышто ондак возымо улмыжым пеҥгыдемден (рис. 3F) (29). Вашталтыш дене таҥастарымаште, SK-OV-3 овариум шешкын клетке линийже кок транспортерын кугу кӱкшытшӧ дене палдарен (рис. 3F).
Т-клетке-влакын йот МНК-м шыҥдарен кертмыштым тергаш манын, таза донор Т-клетке-влакым МНК-н тӱрлӧ концентрацийже улмо годым 72 шагат жапыште куштеныт. Экзогенный МНА уке годым МНА-н клетке содержанийжым пален налаш ок лий (3G рис.). Туге гынат, экзогенный МНА дене эмлыме активированный Т-клетке-влак клеткылаште МНА содержанийын дозо деч шога кугеммыжым ончыктеныт, 6 мМ МНА марте (рис. 3Г). Тиде лектыш ончыкта, транспортер экспрессийын изи кӱкшытшӧ да внутриклеточный МНК метаболизмлан ответственный тӱҥ фермент уке гынат, ТИЛ эше МНК-м налын кертеш.
Пациент-влакын Т-клеткыштышт метаболит-влакын спектрышт да in vitro МНК-м поглощений эксперимент-влак рак дене кылдалтше фибробласт-влакын (КАФ) МНК-м секретироватлыме йӧныштым кугемдат, а шешкым клетке-влак ТИЛ-ын фенотипшым да функцийжым регулироватлен кертыт. МНА-н Т-клетке-влаклан эҥгекшым рашемдаш манын, таза донор Т-клетке-влакым МНА улмо але уке годым in vitro активироватленыт, нунын пролиферацийыштым да цитокин ыштен лукмыштым акленыт. Эн кугу доз дене МНА-м ешарыме деч вара 7 кече жапыште калыкын кок пачаш кугемме чотшо кокла шот дене шагалемын, а чыла дозышто вий-куатым арален коден (4А рис.). Тылеч посна, экзогенный МНК-м эмлыме годым CD4 + да CD8 + Т-клетке-влакын ужашышт кугемын, нуно опухоль некроз фактор-α (TNFα; рис. 4В) экспрессироватлат. Вашталтышлан, CD4 + Т-клеткыште IFN-γ-н внутриклеточный производствыжо ятырлан шагалемын, но CD8 + Т-клеткыште огыл, да интерлейкин 2-ште (IL-2; рис. 4, C да D) кугу вашталтыш лийын огыл. Сандене, фермент дене кылдалтше иммуносорбент анализ (ИФА) тиде МНА-обрабатыватлыме Т-клетке культур гыч супернатант-влак TNFα ятырлан кугеммашым, IFN-γ иземмашым да IL-2 вашталтышым ончыктен (4-ше рис, E гыч G марте). . IFN-γ шагалеммаш ончыкта, молан манаш гын, МНА Т-клетке-влакын противоопухолевый активностьыштым тормозитлымаште рольым модын кертеш. Т-клетке-влакын медиироватьлыме цитотоксичностьыштлан МНА-н эффектыжым моделироватлаш манын, таза донор периферический вӱр мононуклеарный клетке-влак (ПБМК) дене регулироватлыме фолат рецептор α да CAR-T (GFP) цельыш шушо химерный антиген рецептор Т (FRα-CAR-T) клетке-влакым ыштен луктыт. CAR-T клетке-влакым 24 шагат жапыште МНА улмо годым куштеныт, вара айдеме SK-OV-3 оварий шешкым клетке-влак дене пырля куштеныт, нуно фолат рецептор α-м экспрессироватлат, эффектор ден цель коклаште 10:1 коэффициент дене. МНА дене эмлыме годым FRα-CAR-T-клетке-влакын пуштмо активностьышт ятырлан шагалемын, тидыже аденозин дене эмлыме FRα-CAR-T-клетке-влак дене икгай лийын (4Н рис.).
(А) 7-ше кечын культур гыч тура илыше клетке-влакын чотышт да популяций кок пачаш кугеммаш (ПД). Гистограммыште шым таза донор-влакын кокла + SEM-ышт ончыкталтеш. Кеч n = 3 посна эксперимент гыч данныйым ончыкта. (B to D) CD3/CD28 да IL-2 7 кече жапыште Т-клетке-влакым шке МНК концентрацийыштышт активироватлаш кучылталтше. Анализ деч ончыч клетке-влакым 4 шагат жапыште GolgiStop дене PMA/иономицин дене кумылаҥденыт. TNFα (B) экспрессий Т-клеткыште. Илыше клеткылаште TNFα экспрессийын примерже (шолаште) да таблице данный (пурлаште). Т-клеткыште IFN-γ (C) да IL-2 (D) экспрессий. Цитокин-влакын экспрессийыштым проточный цитометрий дене висыме. Гистограммыште кокла шот (n = 6 таза донор) + SEM ончыкталтеш. Р значенийым рашемдаш дисперсийын ик могырым анализшым да угыч ыштыме мер-влакым (*Р<0,05 да **Р<0,01) кучылтман. Кеч n = 3 посна эксперимент гыч данныйым ончыкта. (E to G) CD3/CD28 да IL-2 7 кече жапыште Т-клетке-влакым шке МНК концентрацийыштышт активироватлаш кучылталтше. ПМА/иономицин дене 4 шагат жапыште кумылаҥдыме деч ончыч да вара средам погеныт. TNFα (E), IFN-γ (F) да IL-2 (G) концентраций-влакым ИФА дене висыме. Гистограмме кокла шот дене ончыкта (n = 5 таза донор) + SEM. Р значенийым дисперсийын ик могырым анализше да угыч висымаш дене рашемдыме (*Р<0,05). Точечный линий рашемдыме чекшым ончыкта. (H) Клетке лизис анализ. FRα-CAR-T але GFP-CAR-T клетке-влакым 24 шагат жапыште аденозин (250 мкМ) але МНА (10 мМ) дене келыштарыме але обрабатыватлыде кодымо (Ctrl). SK-OV-3 клетке-влакын процент пуштмыштым висыме. Р значенийым Уэлчын t-тестше дене рашемдыме (*Р<0,5 да **Р<0,01).
МНА-зависимый ТНФα экспрессий регулироватлымашым механистический умылымашым налаш манын, МНА-обрабатыватлыме Т-клетке-влакын ТНФα мРНК-штышт вашталтышым акленыт (рис. 5А). МНА дене эмлыме таза донор Т-клетке-влак TNFα транскрипций кӱкшытым кок пачаш кугемдымым ончыктеныт, тидыже MNA TNFα транскрипций регулироватлымаш деч шога манын ончыкта. Тиде лийын кертше регуляторный механизмым шымлаш манын, TNFα-м регулироватлыше кок палыме транскрипций факторым, лӱмнержым, активированный Т-клетке ядерный фактор (NFAT) да специфический белок 1 (Sp1), MNA-н проксимальный TNFα промотор дене кылдалтмыжлан вашмут семын акленыт ( 30). TNFα промотор 6 палемдыме NFAT связывающий сайт да 2 Sp1 связывающий сайт уло, ик верыште перныл [-55 базовый пар (bp) гыч 5'cap] (30). Хроматин иммунопреципитация (ХИП) ончыктен, мом ыштыме годым МНА дене, ушымаш Sp1 TNFα промотор кум пачаш кугемын. НФАТ-ым пуртымаш тыгак кугемын да кӱлешлыкше деке лишемын (рис. 5В). Тиде данный-влак ончыктат, молан манаш гын, МНА Sp1 транскрипций гоч TNFα экспрессийым регулироватлымаш, а шагалрак кӱкшытыштӧ NFAT экспрессий.
(А) МНА деч посна куштымо Т-клетке-влак дене таҥастарымаште, МНА дене эмлыме Т-клеткыште ТНФα экспрессийын пачаш вашталтышыже. SEM дене экспрессий образец ончыкталтеш (n = 5 таза донор). Кеч n = 3 посна эксперимент гыч данныйым ончыкта. (B) TNFα промотор Т-клетке-влак дене але 8 мМ МНА деч посна обрабатыватлыме деч вара NFAT да Sp1 4 шагат жапыште (Ctrl) да PMA/иономицин кумылаҥдыме дене пырля лийыныт. Иммуноглобулин G (IgG) ден H3 иммунопреципитацийлан отрицательный да положительный контроль семын кучылталтыныт. ChIP-ын количествыже ончыктен: MNA-обрабатыватлыме клеткылаште Sp1 ден NFAT-ын TNFα промотор дене кылдалтмышт контроль дене таҥастарымаште икмыняр пачаш кугемын. Кеч n = 3 посна эксперимент гыч данныйым ончыкта. Р значенийым икмыняр t-тест дене рашемдыме (*** Р <0,01). (C) HGSC-н асцитше дене таҥастарымаште, Т-клетке-влак (цитотоксичный огыл) шешкым TNF-ын кугемдыме экспрессийжым ончыктеныт. Тӱс-влак тӱрлӧ пациент-влакым ончыктат. Ончыктымо ячейке-влакым случайный йӧн дене 300 марте ойыреныт да ӱлыкӧ нӧлталтмашым чактараш манын, дрожьым ыштеныт (** Padj = 0,0076). (D) Оварий раклан МНА-н темлыме модельже. МНА ТМЭ-ште шешке клеткыште да фибробластыште лектеш да Т-клетке-влак дене налыт. МНА Sp1-ын TNFα промотор дене кылдалтмыжым кугемда, тидыже TNFα транскрипцийым да TNFα цитокиным ыштен лукмашым кугемда. МНА тыгак IFN-γ иземмашым луктеш. Т-клетке-влакын пашаштым локтылмаш пуштмо вийыштым иземда да шешкын кушмашыжым писынрак ышта.
Отчет почеш, TNFα ончыл да почеш антиопухолевый да антиопухолевый эффектым куча, но тудо рак овуляцийын кушмашыжым да метастазшым кумылаҥдымаште кумдан палыме рольым модеш (31-33). Отчет почеш, рак дене черланыше-влакын асцитыштышт да шешкым тканьыштышт TNFα-н концентрацийже доброкачественный тканьлаште деч кугурак (34-36). Механизм шотышто TNFα ош вӱр клетке-влакын активацийыштым, функцийыштым да пролиферацийыштым регулироватлен кертеш, рак клетке-влакын фенотипыштым вашталтен кертеш (37, 38). Тиде лектыш дене келшышын, дифференциальный ген экспрессий анализ ончыктен, молан манаш гын, ТНФ ятырлан ӱлыкӧ-регулироватлымаш лийын Т-клеткыште шешкым тканьыште асцит дене таҥастарымаште (рис 5С). ТНФ экспрессийын кугеммыже цитотоксичный огыл фенотипан Т-клетке популяцийыште гына палдырна (рис. S5A). Иктешлен каласаш гын, тиде данный-влак тыгай шонымашым пеҥгыдемдат: МНА-н HGSC-ште кок иммуносупрессивный да шешкым кумылаҥдыше эффектыже уло.
Проточный цитометрий негызеш флуоресцентный маркироватлымаш ТИЛ метаболизмым шымлыме тӱҥ йӧн лийын. Тиде шымлымаш ончыктен: периферический вӱр лимфоцит але вторичный лимфоидный органла гыч Т-клетке-влак дене таҥастарымаште, мышиный да айдеме ТИЛ-ын глюкозым налме тенденцийже кугурак (4, 39) да митохондриальный функцийын эркын-эркын йоммыжо (19, 40). Тиде шымлымашыште тыгаяк лектышым эскеренна гынат, тӱҥ вияҥмаш — икгай резекциян шешке ткань гыч шешке клетке ден ТИЛ-ын метаболизмыштым таҥастараш. Тиде ончычсо отчет-влак кокла гыч южышт дене келшышын, асцит да шешкым гыч лекше шешкым (CD45-EpCAM +) клетке-влак CD8 + да CD4 + Т-клетке-влак деч кугурак глюкозым налыт, тидыже шешкым клетке-влакын кугу глюкозым налмыштым Т-клетке-влак дене таҥастараш лиеш манын пеҥгыдемда. Т-клетке-влакын таҥасымашышт нерген умылымаш. ТМЭ. Туге гынат, шешке клетке-влакын митохондриальный активностьышт CD8 + Т-клетке-влак деч кугурак, но митохондриальный активность CD4 + Т-клетке-влакын активностьышт дене икгай. Тиде лектыш-влак лекше темым пеҥгыдемдат, молан манаш гын, окислительный метаболизм шешке клетке-влаклан кӱлешан (41, 42). Нуно тыгак темлат, CD8 + Т-клетке-влак CD4 + Т-клетке деч оксидативный дисфункцийлан утларак эҥертен кертыт, але CD4 + Т-клетке-влак митохондриальный активностьым арален кодашлан глюкоза деч моло углерод источник-влакым кучылт кертыт (43, 44). Палемдыман, ме асцит годым CD4 + Т эффектор, Т эффектор шарнымаш да Т рӱдӧ шарнымаш клетке-влак коклаште глюкозым налме але митохондриальный активность шотышто ойыртемым эскерен огынал. Тыгак CD8 + Т-клетке-влакын дифференциаций состоянийышт шеҥгелне глюкозым налме вашталтыш дене нимо денат кылдалтын огыл, тидыже in vitro куштымо Т-клетке ден in vivo айдеме TIL коклаште кугу ойыртемым ончыкта (22). Тиде эскерымаш-влакым тыгак беспристрастный автоматический клетке популяцийым шеледымашым кучылтмо дене пеҥгыдемдыме, тидыже умбакыже ончыктен: CD45 + / CD3- / CD4 + / CD45RO + клетке-влак, глюкозым утларак налше да митохондриальный активность дене, шеҥгел клетке-влак деч утларак шарленыт, но нунын Метаболический активный клетке популяцийышт уло. Тиде популяций scRNA-seq анализыште палемдыме миелоидный супрессор клетке-влакын але плазмоцитоидный дендритный клетке-влакын предполагаемый субпопуляцийыштым ончыктен кертеш. Тиде коктынат айдеме овариальный шешкым ыштыме нерген увертареныт гынат [45], нуно эше кӱлеш Умбакыже пашам ышташ тиде миелоидный субпопуляцийым сӱретлаш.
Проточный цитометрий негызеш ыштыме йӧн-влак клетке тип коклаште глюкозын да оксидативный метаболизмын чумыр ойыртемжым рашемден кертыт гынат, ТМЭ-ште митохондриальный метаболизмлан глюкоза але вес углерод источник-влак дене ыштыме раш метаболит-влакым эше рашемдыме огыл. Пуымо TIL подмножествылан метаболит-влакын улмыштым але укелыкыштым палемдыме годым лукмо ткань гыч клетке популяцийым эрыкташ кӱлеш. Сандене мемнан клетке-влакым пойдарыме йӧн масс-спектрометрий дене пырля пациент-влакын образецыштым келыштарыме годым Т-клеткыште да шеҥгел клетке-влакын популяцийыштышт ойыртемалтше пойдаралтше метаболит-влак нерген умылымашым пуэн кертеш. Тиде йӧн флуоресценций дене активироватлыме клетке-влакым сортироватлыме деч сай могыржо уло гынат, южо метаболит библиотеке-влаклан шкешотан пеҥгыдылык да/але писын савырныме темплан кӧра локтылалт кертеш (22). Туге гынат, мемнан йӧн кок палыме иммуносупрессивный метаболит-влакым, аденозин ден кинуренин, пален налын кертын, вет нуно образец тип коклаште чот ойыртемалтыт.
Мемнан метабономический анализ шешкым да ТИЛ подтип-влакым утларак умылымашым пуа, рольым метаболит-влак овариальный ТМЭ. Икымше, проточный цитометрийым кучылтын, ме рашемдышна: шешкым да CD4 + Т-клетке-влак коклаште митохондриальный активностьышто ойыртем уке. Туге гынат, LC-MS/MS анализ нине популяций коклаште метаболит-влакын шуко улмышт шотышто кугу вашталтышым ончыктен, тидыже ончыкта: TIL метаболизм да тудын чумыр метаболический активностьшо нерген иктешлымашым ышташ тӱткын умылтараш кӱлеш. Кокымшо, МНА — асцитыште CD45-клетке ден Т-клетке коклаште эн кугу ойыртем дене метаболит, шешкым огыл. Сандене, компартментирование да шешкын верланымыже ТИЛ метаболизмлан тӱрлӧ эффектым пуэн кертыт, тидыже пуымо микросредаште лийын кертше гетерогенностьым ончыкта. Кумшо, МНК-влакым ыштен лукшо фермент ННМТ-н экспрессийже тӱҥ шотышто CAF дене гына чак кылдалтын, тудо шагалрак шеҥгел клетке-влак улыт, но шеҥгел гыч лекше Т-клеткыште рашемдыме МНА кӱкшытым эскерат. Овариальный CAF-ыште NNMT-н ӱлнӧ экспрессийже ракым кумылаҥдыше палыме эффектым пуа, тидыже CAF-ын метаболизмжым, шешкын инвазийжым да метастазым вияҥдыме дене кылдалтын (27). TIL-ын чумыр кӱкшытшӧ кокла гынат, CAF-ыште NNMT-н экспрессийже Cancer Genome Atlas (TCGA) мезенхимный подтип дене чак кылдалтын, тудо начар прогноз дене кылдалтын (27, 46, 47). Пытартышлан, МНК-н локтылалтмыжлан вуйын шогышо AOX1 ферментын экспрессийже тыгак CAF популяций дене гына чак кылдалтын, тидыже ончыкта: Т-клетке-влакын МНК-м метаболизироватлаш вийышт уке. Тиде лектыш-влак тыгай шонымашым пеҥгыдемдат: тиде мумашым тергаш умбакыже пашам ышташ кӱлеш гынат, Т-клеткыште МНА-н кугу кӱкшытшӧ иммуносупрессивный КАФ микросреда улмым ончыктен кертеш.
МНА транспортер-влакын экспрессий кӱкшытыштым да МНА метаболизмыште участвоватлыше тӱҥ белок-влакын палыдыме кӱкшытыштым шотыш налын, Т-клеткыште МНА улмыжо вучыдымо. Ни NNMT, ни AOX1 кок посна когортын scRNA-seq анализ да целевой qPCR дене пален налын кертын огытыл. Тиде лектыш ончыкта, молан манаш гын, МНА Т-клетке-влак дене огыл синтезироватлалтеш, а йырым-йырысе ТМЭ гыч шыҥдаралтеш. In vitro эксперимент-влак ончыктат, Т-клетке-влак экзогенный МНК-м погаш тыршат.
Мемнан in vitro шымлымашна ончыктен: экзогенный МНА Т-клеткыште TNFα экспрессийым тарвата да Sp1-ын TNFα промотор дене кылдалтмыжым кугемда. TNFα противоопухолевый да противоопухолевый функцийым шукта гынат, овариум рак годым TNFα овариум ракын кушмашыжым кумылаҥден кертеш (31-33). ТНФα-н нейтрализацийже овариальный шешке клетке культурышто але чыве модельыште ТНФα сигналым кораҥдымаш ТНФα-медиировать воспалительный цитокин производствым саемден кертеш да шешке кушмашым тормозитлен кертеш (32, 35). Сандене, тиде случайыште, ТМЭ-производный МНА провоспалительный метаболит семын выступатлен кертеш TNFα-зависимый механизм гоч аутокринный петле гоч, тыге рак овариумын лиймыжым да шарлымыжым кумылаҥден (31). Тиде йӧнлан эҥертен, TNFα блокадым коваште раклан эмлыме йӧн семын шымлат (37, 48, 49). Тылеч посна, МНА CAR-T клетке-влакын цитотоксичностьыштым оварий шешкын клеткыже-влаклан локтылеш, тидыже МНА-медиировать иммунный подавленийлан эше ик доказательствым пуа. Чылаже, тиде лектыш-влак тыгай модельым темлат, кушто шешкым да CAF клетке-влак МНА-м внеклеточный ТМЭ-шке секретироватлат. (i) ТНФ-индуцированный рак оварий кушмашым кумылаҥдыме да (ii) МНА-индуцированный Т-клетке цитотоксический активность торможитлыме гоч, тиде кок шешкым эффектым ыштен кертеш (рис. 5D).
Иктешлен каласаш гын, писын клетке пойдарымаш, ик клетке секвенирование да метаболический профилироватлымаш комбинацийым кучылтын, тиде шымлымаш HGSC пациент-влакын шешкым да асцит клетке-влак коклаште кугу иммунометаболомический ойыртемым почын пуэн. Тиде комплексный анализ ончыктен, мо ойыртем уло глюкоза поглощение да митохондриальный активность коклаште Т-клетке-влак, да палемдыме МНА неклеточный автономный иммунный регуляторный метаболит. Тиде данный-влак айдеме ракыште ТМЭ-н Т-клетке-влакын метаболизмыштлан кузе эҥгекым ыштымыжлан влиянийым ыштат. Т-клетке ден рак клетке-влак коклаште кочкыш веществалан тура конкуренций нерген увертареныт гынат, метаболит-влак тыгак косвенный регулятор семын выступатлен кертыт, шешкым вияҥдаш полшаш да, очыни, эндогенный иммунный вашмутым локтылташ. Тиде регуляторный метаболит-влакын функциональный рольыштым умбакыже сӱретлыме годым антиопухолевый иммунный вашмутым кугемдыме альтернативный стратегий-влак почылт кертыт.
Пациент-влакын образецыштым да клинике данныйыштым Канадын ткань репозиторий сетьше дене сертифицироватлыме BC рак шешкын ткань репозиторийже гоч налыныт. Британийысе Колумбийысе ракым шымлыме этике комитетын да Британ Колумбийысе университетын (H07-00463) пеҥгыдемдыме протоколышт почеш, чыла пациентын образецше да клинике данныйже-влак информированный возымо келшымашым налыныт але нунын келшымашышт деч официально кораҥыныт. Образец-влак сертифицироватлыме Биобанкыште (BRC-00290) аралалтыт. Пациент-влакын лончылымо характеристикышт S1 да S5 таблице-влакыште ончыкталтеш. Криоконсервацийлан скальпель дене пациентын шешкым налме образецшым механике йӧн дене шалатат, вара тудым 100 микрон фильтр гоч луктын, ик клетке суспензийым налыт. Пациентын асцитшым 1500 об/мин 10 минут жапыште 4°C температурышто центрифугироватлыме, клетке-влакым пеллетироватлаш да ӱмбалым кораҥдаш манын. Шинча да асцит гыч налме клетке-влакым 50% шокшо дене инактивироватлыме айдеме AB шӧрыштӧ (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) да 10% диметилсульфоксидыште криоконсервироватлыме. Тиде арален кодымо ик клетке суспензий-влакым йӱлалтеныт да йымалне ончыктымо метаболомиклан да метаболит-влакым рашемдыме годым кучылтыныт.
Пӱтынь среда 0,22 мкм фильтроватлыме 50:50 ешартыш RPMI 1640: AimV гыч шога. RPMI 1640 + 2,05 мМ l-глутамин (Thermo Fisher Scientific) 10% шокшо дене инактивироватлыме айдеме AB сыворотко (Sigma-Aldrich), 12,5 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 мМ l-глутамин (Thermo Fisher Scientific) дене ешартышым ыштен, x1 Пенициллин Стрептомицин (PenStrep) раствор (Thermo Fisher Scientific) да 50 мкМБ-меркаптоэтанол. AimV (Invitrogen) 20 мМ Hepes (Thermo Fisher Scientific) да 2 мМ l-глутамин (Thermo Fisher Scientific) дене ешаралтын. Проточный цитометрын чиялтыме буферже 0,22 мкм фильтроватлыме фосфат буферный физиологический раствор (PBS; Invitrogen) гыч шоген, тудым 3% шокшо дене инактивироватлыме AB айдеме шӧр (Sigma) ешареныт. Клетке-влакым пойдарыме буфер 0,22 мкм фильтроватлыме ПФС гыч шога да 0,5% шокшо дене инактивироватлыме айдеме АВ шӧр (Сигма-Ольдрих) дене ешаралтын.
37°C тичмаш средаште клетке-влакым 10 нМ МТ ДР да 100 мкМ 2-НБДГ дене 30 минут жапыште чиялтеныт. Умбакыже клетке-влакым 15 минут жапыште 4°C температурышто eF506 илыш краситель дене чиялтеныт. Клетке-влакым FC Block (eBioscience) да Brilliant Stain Buffer (BD Biosciences) дене угыч суспендироватлыза, проточный цитометр дене чиялтыме буферыште (производительын инструкцийже почеш) луштарыза да пӧлем температур годым 10 минут инкубироватлыза. Клетке-влакым 4°C температурышто 20 минут жапыште проточный цитометрий дене чиялтыме буферыште антитела набор дене (S2 табл.) чиялтыза. Анализ деч ончыч клетке-влакым проточный цитометрий дене чиялтыме буферыште (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигураций) угыч суспендироватлыза. Клетке-влакын шотлымо данныйыштым лончылаш SpectroFlo ден FlowJo V10-ым кучылтман, а данныйым ышташлан GraphPad Prism 8-ым кучылтман. Медиана флуоресценция интенсивность (МФИ) 2-NBDG да MT DR лог-нормироваться, а вара парный t-тест статистике анализлан кучылталтше, келшен толшо пациент-влакым шотыш налын. Анализ гыч 40 деч шагалрак событий дене чыла популяцийым кораҥдаш; статистике анализ ден данный-влакым ончыктымо деч ончыч кеч-могай отрицательный значенийлан 1 МФИ значенийым пурто.
Ӱлнӧ ончыктымо процесс панельын кид дене ыштыме шлюз стратегийжым ешарен, ме формо ограничительный пушеҥге (FAUST) (21) дене тичмаш аннотацийым кучылтынна, FlowJo-што колышо клетке-влакым кораҥдымеке, популяцийлан клетке-влакым автоматически ойыраш манын. Ме лектышым кид дене виктарена, тыге чучеш, чын огыл ойырымо (PD1+ дене PD1-шешке клетке-влакым ушен) да арален кодымо популяций-влакым ушен шогена. Кажне образецыште кокла шот дене 2% утла клетке уло, чылаже 11 популяцийлан.
ПБМК-м лейкоцит ойырен налме продукт деч ойырашлан Фиколл градиент плотность центрифугироватлымашым кучылтыныт (STEMCELL Technologies). CD8 + Т-клетке-влакым PBMC гыч CD8 MicroBeads (Miltenyi) дене ойыреныт да 2 арня жапыште производительын инструкцийже почеш TransAct (Miltenyi) дене тичмаш средаште кумдаҥденыт. Клетке-влакым 5 кече жапыште IL-7 (10 нг/мл; PeproTech) дене тичмаш средаште шогаш пуэныт, вара TransAct дене угыч кумылаҥденыт. 7-ше кечын, производительын инструкцийже почеш, кум радам дене клетке-влакым пойдараш айдеме CD45 MicroBeads (Miltenyi) кучылталтше. Клетке-влакым проточный цитометрий анализлан шеледеныт (ӱлнӧ ончыктымо семын), а ик миллион клеткым LC-MS/MS анализлан кум гана шеледеныт. Образец-влакым йымалне ончыктымо семын LC-MS/MS йӧн дене обрабатыватленыт. Ме 1000 ион числа дене йомшо метаболит значенийым шотлен луктынна. Кажне образец чумыр ион числа дене (TIC) нормализоватлалтеш, логарифмически савырна да анализ деч ончыч MetaboAnalystR-ыште автоматически нормализоватлалтеш.
Кажне пациентын ик клетке суспензийжым 40 мкм фильтр гоч йӱлалтеныт да тичмаш средашке (ӱлнӧ ончыктымо семын) луктыныт. Производительын протоколжо почеш, CD8+, CD4+ да CD45- клетке-влаклан (лум ӱмбалне) образец-влакым пойдараш манын, MicroBeads (Miltenyi) дене пайдаланен, магнит шарикым ойырен налме дене кум радам дене позитивный ойырен налме турым кучылтыныт. Кӱчыкын каласаш гын, клетке-влакым клетке-влакым пойдарыме буферыште (ӱлнӧ ончыктымо семын) угыч шыҥдарат да шотлат. Клетке-влакым айдеме CD8 шергаш, айдеме CD4 шергаш але айдеме CD45 шергаш (Miltenyi) дене 4°C 15 минут жапыште инкубироватьленыт, вара клетке-влакым пойдарыме буфер дене мушмо. Образецым LS колонко (Miltenyi) гоч эртарат, да положительный да отрицательный фракций-влакым погат. Жапым иземдаш да клетке-влакым нӧлталме ошкылым кугемдаш манын, вара CD8-фракцийым CD4+ пойдарымашын кокымшо турыштыжо кучылтыт, а CD4-фракцийым умбакыже CD45-пойдарымашлан кучылтыт. Ойырымо процесс мучко лум ӱмбалне растворым кучыза.
Метаболит анализлан образец-влакым ямдылаш манын, клетке-влакым ик гана йӱштӧ шӧр раствор дене мушмо, кажне образецыш 1 мл 80% метанол ешареныт, вара вихревой йӧн дене йӱлалтеныт да жидкий азот дене йӱлалтеныт. Образец-влакым кум морозильный-оттаивание циклыште эртареныт да 14 000 об/мин 15 минут жапыште 4°C температурышто центрифугироватленыт. Метаболит-влакым налше супернатант йӱлен пытымешке йӱлалта. Метаболит-влакым 50 мкл 0,03% муравейник кислоташте уэш эрыктеныт, мешаяш вихревой йӧн дене луктыныт, вара шӱкшакым кораҥдаш центрифугироватленыт.
Ӱлнӧ ончыктымо семын метаболит-влакым лукса. Метаболомикым шымлашлан супернатантым кӱкшӧ лектышан жидкостной хроматографий бутылкыш кусарыза. Случайный обрабатыватлыме протоколым кучылтын, кажне образецым икгай числан клетке дене обрабатыватлаш, пакетный эффектым чараш манын. Ме AB SCIEX QTRAP 5500 кум квадрупольный масс-спектрометрыште (50) ончыч савыкталтше тӱнямбал метаболит-влакым качественный аклымашым эртаренна. Хроматографический анализ да пик кумдыкым интеграций MultiQuant 2.1 версий программе полшымо дене ыштыме (Applied Biosystems SCIEX).
Ион шот дене 1000 метаболит значенийжым шотлаш кучылталтше, да кажне образецын ТИК-ше кажне палемдыме метаболитын нормализоватлыме пиковый кумдыкшым шотлаш кучылталтше, образецым обрабатыватлыме гыч инструментальный анализ дене пуртымо вашталтышым тӧрлаташ манын. TIC нормализоватлыме деч вара, MetaboAnalystR(51) (умолчание параметр) логарифмический савыртышлан да автоматический нормо линий масштабироватлымашлан кучылталтеш. Ме образец тип коклаште метаболом ойыртемым шымлыме анализлан веганский R пакет дене ПКА-м кучылтынна, а пациент-влакым лончылаш ужаш избыточность анализым кучылтынна. Уорд йӧн дене пайдаланен, образец-влак коклаште евклидовский торалыкым чумыраш шокшо картын дендрограммыжым чоҥаш. Ме стандартизированный метаболит шуко улмо шотышто лимма (52) дене пайдаланенна, уло клетке тип да микросредыште дифференциально шуко метаболит-влакым палемдаш манын. Умылтарымашым куштылемдаш манын, ме модельым ончыкташ тӱшка кокла параметр дене пайдаланена, да кажне тӱшка семын микросредаште клетке тип-влакым шотлен луктына (n = 6 тӱшка); значений тергымашлан ме кажне метаболитлан кум гана висымашым эртаренна Шоя репликаций деч утлаш манын, пациент лимма дизайныште препятствий семын пуртымо. Тӱрлӧ пациент коклаште метаболит-влакын ойыртемыштым тергаш манын, ме пациент-влакым пеҥгыдемдыме йӧн дене пуртымо лимма модельым келыштаренна. Ме Padj <0,05 (Бенджамини-Хохберг тӧрлатымаш) клетке тип ден микросреда коклаште ончылгоч палемдыме контрастын кӱлешлыкшым увертарена.
Miltenyi Dead Cell Removal Kit (>80% viability) дене пайдаланен, вийым пойдарыме деч вара, 10x 5′ген экспрессий протокол дене пайдаланен, ик клетке транскриптом секвенирование чумыр илыше морозильный асцит да шешкым образец-влак ӱмбалне эртаралтын. Вич случай дене келшыше шешкым да асцитым лончыленыт, гынат ик шешкын образецше гыч илышыш шыҥдаралтмаш шагал улмылан кӧра тудым пурташ чаракым ыштен. Пациент-влакым шуко ойырен налаш манын, ме кажне пациентын образецшым 10x хром контроллерын полосалаштыже ушенна, асцит ден шешкын вержым посна лончыленна. Секвенирование деч вара [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp парный мучаш (PE), Квебек геном; кокла шот дене 73,488 да 41,378 лудмаш кажне клеткыште шешкым да асцитым шот дене]], ме CellSNP да Vireo (53) кучылтынна (CellSNP негызеш кузе GRCh38 пуымо тыглай айдеме SNP (VCF) донор идентичностьым пуалтеш. Ме SNPRelate-ым кучылтына, пациент-влакын эн лишыл идентичностьыштым (IBS) генотип (IBS) статусшым рашемдаш манын дуплекс семын палемдыме да асцит ден шешкын образецше-влак коклаште келыштарыме донор-влакым шотыш налын, ме кум случайым арален коденна, кушто шешкым да асцитым йымалне лончылымашлан массовый фильтраций ошкылым ыштымеке, скатерыште (55) да скраныште (56) BioConductor, тиде клетке-влакым упаковывать 7975. (2792 да 4183 клетке-влак шешкым да асцит гыч, шот дене) анализлан ме igraph-ын (57) Louvain кластеризацийжым кучылтына, тудо экспрессий дене кластер клетке-влак деч тораште улшо Кластер-влакым TNE-маркер негызеш предполагаемый клетке типлан кид дене аннотироватленыт. клетке-влак CD8A ден GZMA экспрессий дене рашемдалтыт, рибосомный белокын изи экспрессийже дене подкластер-влакым шотлыде. Ме Izar et al. (16) савыкталтше данный-влак деке пуренна, нунын t-SNE встраиванийыштым пуртымо, иммунный клетке маркер ден NNMT экспрессий коклаште экспрессий перпендикулярностьым виктарен кертеш.
ПБМК-м лейкоцит ойырен налме продукт деч (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент плотность центрифугироватлымаш дене ойыреныт. CD3 + клетке-влакым PBMC гыч CD3 шергаш дене ойыреныт (Miltenyi). МНА улмо годым але уке годым CD3+ клетке-влакым пластинке дене кылдалтше CD3 (5 мкг/мл), растворимый CD28 (3 мкг/мл) да IL-2 (300 Е/мл; Пролейкин) дене активироватленыт. Кумдаҥдыме пытартыш кечын илышыш шыҥдаралтме (Fixable Viability Dye eFluor450, eBioscience) да пролифераций (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) йогын цитометрий дене акленыт. Эффектор функцийым аклаш, 4 шагат жапыште GolgiStop дене PMA (20 нг/мл) да иономицин (1 мкг/мл) дене клетке-влакым кумылаҥден, да CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4) , BioLegend) да TNFα-флуоресцетианат (TCFI1) мониторингым эртараш БД). qPCR да ChIP клетке-влакым PMA (20 нг/мл) да иономицин (1 мкг/мл) дене 4 шагат жапыште кумылаҥдаш. ИФА-н супернатантшым 4 шагат жапыште ПМА (20 нг/мл) да иономицин (1 мкг/мл) дене кумылаҥдыме деч ончыч да вара погеныт.
RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) дене пайдаланен, РНК-м ойырен налашлан производительын протоколжым шукташ кӱлеш. Образецым гомогенизироватлаш QIAshredder (QIAGEN) кучылтман. Комплементарный ДНК-м (кДНК) синтезироватлаш кугу куатан РНК- гыч кДНК-шке комплектым (Thermo Fisher Scientific) кучылтман. TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) дене пайдаланен, ген экспрессийым (производительын протоколжо почеш) тыгай зонд-влак дене шотлаш лиеш: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs0042755151511111111 Hs02786624_g1 [глицеральдегид-3-фосфат офф водород (GAPDH)] да Hs01010726_m1 (SLC22A2). Образец-влакым StepOnePlus реальный жапыште ПЦР системыште (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) MicroAmp писын оптике 96-лук реакций плиткыште (Applied Biosystems) MicroAmp оптике плёнко дене ыштеныт. Кеч-могай Ct значений, 35 деч кугурак, рашемдыме порог деч ӱлнӧ шотлалтеш да рашемдыме семын палемдалтын.
ChIP-ым ончычсо семынак ыштыза (58). Кӱчыкын каласаш гын, клетке-влакым формальдегид дене (пытартыш концентраций 1,42%) обрабатыватленыт да 10 минут жапыште пӧлем температур годым инкубироватленыт. Ешартыш шӱшмӧ буферым (25 мМ Hepes, 1,5 мМ MgCl2, 10 мМ KCl да 0,1% NP-40) лум ӱмбалне 10 минут жапыште кучылташ, вара иммунопреципитация буферыште угыч суспензировать, кузе сӱретлалтеш (58 ). Вара образецым тыгай цикл дене йӱктеныт: 10 цикл (20 1-секунд импульс) да 40 секунд статике жап. ChIP-класс иммуноглобулин G (Cell Signaling Technology; 1μl), гистон H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) да SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) антитела-влакым 4°CC температур годым йӱдым лӱҥгалтарыза. А белок шергаш-влакым (Thermo Fisher Scientific) образец дене 4°C температурышто 1 шагат жапыште ласкан лӱҥгалтарыза, вара ДНК-м пойдараш chelex шергаш-влакым (Bio-Rad) кучылтман, а белокым йӱлалтыме годым протеиназа К (Thermo Fisher) кучылташ. TNFα промоторым ПЦР дене пален налме: ончыко, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; ваштареш, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207-bp продукт). Сӱрет-влакым Image Lab (Bio-Rad) ыштен да ImageJ программе полшымо дене шотлен луктын.
Клетке культурын супернатантшым ӱлнӧ ончыктымо семын погеныт. Рашемдымашым айдеме TNFα ИФА-комплект (Invitrogen), айдеме IL-2 ИФА-комплект (Invitrogen) да айдеме IFN-γ ИФА-комплект (Abcam) производительын процедурыжо почеш эртарыме. Производительын протоколжо почеш, TNFα ден IL-2-ым пален налашлан супернатантым 1:100, а IFN-γ-ым пален налашлан 1:3 дене луктыныт. EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer) дене 450 нм поглощенийым висаш кучылтман.
ПБМК-м лейкоцит ойырен налме продукт деч (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент плотность центрифугироватлымаш дене ойыреныт. CD3 + клетке-влакым PBMC гыч CD3 шергаш дене ойыреныт (Miltenyi). МНА улмо годым але уке годым CD3+ клетке-влакым 3 кече жапыште пластинке дене кылдалтше CD3 (5 мкг/мл), растворимый CD28 (3 мкг/мл) да IL-2 (300 Е/мл; Пролейкин) дене активироватленыт. кече гыч клетке-влакым погеныт да 0,9% физиологический раствор дене мушкыныт, а пеллетым вашке йӱлалтеныт. Клетке-влакым шотлымо годым 123count eBeads дене проточный цитометрий (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R конфигураций) йӧн дене ыштыме.
Ӱлнӧ ончыктымо семын метаболит-влакым лукса. Сухофруктым 4000 клетке эквивалент/мкл концентрацийыште угыч ыштеныт. Образецым вашталтыме фазный хроматографий (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) да CORTECS T3 колонко (2,1×150 мм, 1,6-мкм кугытан, 120-Å кугытан; #186008500, Waters) дене лончылаш. Полярный масс-спектрометр (6470, Agilent), кушто электроспрей ионизаций положительный режимыште пашам ышта. Мобильная фазыже А — 0,1% муравейник кислота (H2O-ште), мобильная фазыже В — 90% ацетонитрил, 0,1% муравейник кислота. 100% А-лан 0 гыч 2 минут марте, 99% В-лан 2 гыч 7,1 минут марте, 99% В-лан 7,1 гыч 8 минут марте. Вара 3 минут жапыште 0,6 мл/мин йогын дене колонкым мобильная фазы А дене угыч эквивалентироватлаш. . Йогын 0,4 мл/мин, а колонко камерым 50°C марте шокшо. MNA-н ару химий стандартшым (M320995, Торонто шымлымаш химий компаний, Северный Йорк, Онтарио, Канада) кучылтман, тудо жапым (RT) да трансформацийым (RT = 0,882 минут, трансформаций 1 = 137→94,1, трансформаций 2 = 137→92 , Конверсий = 17→9333) рашемдаш. Кунам чыла кум кусарыме чын кучымо жапыште лийме годым, 1-ше кусарымашым спецификым ӱшандарыше количественныйлан кучылтыт. МНА-н (Торонто шымлымаш химий компаний) стандарт криволинейныйжым 0,1, 1,0, 10 да 100 нг/мл да 1,0 да 10 мкг/мл шот дене жидкость стандарт-влакым налаш манын, стоковый растворым (1 мг/мл) шым серийный лукмаш дене ыштыме. Палемдыме чек 1 нг/мл, а линейный вашмут 10 нг/мл да 10 мкг/мл коклаште. Кажне инъекций кок микролитр образец да стандарт LC/MS анализлан кучылталтеш, да анализ платформын пеҥгыдылыкшым ӱшандарыше кажне кандаш инъекцийлан аралаш качествым тергыме образецым эртарат. Чыла МНА дене обрабатыватлыме клетке образец-влакын МНА вашмутышт анализын линейный диапазоныштыжо лийыныт. Данный-влакым лончылымаш MassHunter количественный анализ программе дене ыштыме (v9.0, Agilent).
Кокымшо тукым αFR-CAR конструкцийым Song et al. деч налыныт. (59). Кӱчыкын каласаш гын, конструкцийыште тыгай содержаний уло: CD8a лидер радам, айдеме αFR-специфический ик шинчыр вашталтшан фрагмент, CD8a шарнир да трансмембранный регион, CD27 внутриклеточный домен да CD3z внутриклеточный домен. CAR радамым GenScript дене синтезироватлыме, вара трансдукций пайдалыкым аклаш кучылтмо GFP экспрессий кассетын ӱлнӧ улшо кокымшо тукым лентивирусный экспрессий векторыш клонироватлыме.
Лентивирус HEK293T клетке-влакым трансфекций дене ышталтын [Американ тип культур коллекций (ATCC); Dulbecco-н вашталтыме Eagle средаште кушкын, тушто 10% ушкал ӱшкыж шӧр (FBS) да 1% PenStrep уло, да CAR-GFP векторым кучылтыныт да упаковочный плазмид-влак (psPAX2 да pMD2.G, Addgene) липофекций амин (Sigma-Aldrich) кучылтыт. Вирус дене кылдалтше супернатантым трансфекций деч вара 48 да 72 шагат гыч погеныт, фильтроватленыт да ультрацентрифугироватлыме дене концентрироватленыт. Концентрироватлыме вирус супернатант -80°C температурышто трансдукций марте аралаш.
ПБМК-м таза донор лейкоцит ойырен налме продукт деч (STEMCELL Technologies) Ficoll градиент плотность центрифугироватлымаш дене ойырат. PBMC гыч CD8+ клетке-влакым ойырен налашлан позитивный ойырен налме CD8 микрошарик-влакым (Miltenyi) кучылтман. Т-клетке-влакым TransAct (Miltenyi) да TexMACS средаште [Miltenyi; 3% шокшо дене инактивироватлыме айдеме шӧр, 1% PenStrep да IL-2 (300 U/ml) дене ешарен]. Стимулироватлыме деч вара 24 шагат гыч Т-клетке-влакым лентивирус дене (106 клеткылан 10 мкл концентрироватлыме вирус супернатант) трансдукцийым ыштеныт. 1 гыч 3 кече гыч Cytek Aurora (FSC (Forward Scatter)/SSC (Side Scatter), Singlet, GFP+) трансдукций деч вара, клетке-влакын GFP экспрессийыштым аклаш, трансдукций пайдалыкым шагал огыл 30% ончыкташ манын.
CAR-T клетке-влакым 24 шагат жапыште Immunocult (STEMCELL Technologies; 1% PenStrep дене ешарен) тыгай условийыште куштеныт: обрабатыватлыдыме, 250 мкМ аденозин але 10 мМ МНА дене обрабатыватлыме. Ончылгоч обрабатыватлыме деч вара CAR-T клетке-влакым PBS дене мушмо да 20 000 SK-OV-3 клетке дене ушымо [ATCC; Маккой 5А средаште (Сигма-Ольдрих) 10% FBS да 1% PenStrep дене ешарен 10: эффектор да цель коэффициент 1 ешартыш иммунокульт средаште кум гана кугемденыт. SK-OV-3 клетке-влакым да SK-OV-3 клетке-влакым digitalis saponin (0,5 мг/мл; Sigma-Aldrich) дене лизироватлыме, отрицательный да положительный контроль семын кучылталтше. шагат пырля ӱдымӧ деч вара супернатант погеныт да лактат дегидрогеназа (LDH) производительын инструкцийже почеш висыме (LDH Glo Cytotoxicity Assay Kit, Promega). ЛДГ супернатант 1:50 ЛДГ буферыште луктын. Пуштмо процентым тыгай формулым кучылтын висыме: пуштмо процент = тӧрлатымашын процентше / эн кугу пуштмо чот x 100%, кушто тӧрлатымашын процентше = сокультур-Т-клетке-влак гына, а эн кугу пуштмо чот = положительный контроль-отрицательный контроль.
Текстыште але материалыште да йӧнлаште ончыктымо семын, статистике анализлан GraphPad Prism 8, Microsoft Excel але R v3.6.0 программе-влакым кучылтман. Ик пациент деч икмыняр образецым погеныт гын (мутлан, асцит да шешкым), ме парный t-тестым кучылтына але пациентым случайный эффект семын линейный але обобщенный модельыш пуртена. Метаболомик анализлан кӱлешлык тергымашым кум экземпляр дене эртарат.
Тиде статьялан ешартыш материалым http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1 сайтыште муаш лиеш
Тиде почылтшо статья, тудо Creative Commons Attribution-Non-Commercial License условий почеш шарлен, тудо кеч-могай йӧн дене кучылташ, шаркалаш да ешарен лукташ йӧным пуа, пытартыш кучылтмаш коммерческий пайдалан огыл гын да тӱҥ паша чын улмылан негыз уло гын. Ссылки.
Палемдыман: Ме тендан деч электрон почто адресым пуаш гына йодына, тыге еҥ, кудым тый лаштыкыш темлет, пала, мом те нунылан электрон почто ужаш шонеда да тиде спам огыл. Ме нимогай электрон почто адресым огына нал.
Тиде йодыш тендан унагудо улмыдам тергаш да автоматический спам колтымо деч аралаш кучылталтеш.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Г. Захариас (Лорен Г. Захариас), Эбигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Брэд Х. Нельсон (Брэд Х. Нельсон), Ральф Дж. Дерард Беллни (Р.Р.Бернис), Деррард. Джонс (Рассел Г. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
МНА Т-клетке-влакын иммунный подавленийыштлан полша да айдеме ракым эмлыме годым иммунотерапий цельым ончыкта.
Мариса К. Килгур (Мариса К. Килгур), Сара Макферсон (Сара Макферсон), Лорен Г. Захариас (Лорен Г. Захариас), Эбигейл Эли Арис Г. Уотсон (Х. Уотсон), Джон Стагг (Джон Стагг), Брэд Х. Нельсон (Брэд Х. Нельсон), Ральф Дж. Дерард Беллни (Р.Р.Бернис), Деррард. Джонс (Рассел Г. Джонс), Финеас Т. Гамильтон (Финеас Т.
МНА Т-клетке-влакын иммунный подавленийыштлан полша да айдеме ракым эмлыме годым иммунотерапий цельым ончыкта.
©2021 Наукым вияҥдыме шотышто американ ассоциаций. чыла правам аралыме. AAAS — HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef да COUNTER-ын партнерышт. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.