Секреторный корнышто белокым сортироватлымаш клетке-влакын шеледымашыштым да гомеостазым арален кодаш кӱлешан. Шелл-медиировать сортироватлымаш деч посна, секреторный транспорт процессыште кинезин сортироватлымаште липид-влакын рольышт — кужу жаплан шогышо тӱҥ йодыш, тудлан эше вашмутым пуэн огытыл. Тыште ме 3D ик жапыште шуко тӱсан кӱкшӧ разрешениян чын жапыште сӱретлымашым ыштена, in vivo доказатлаш манын, у синтезироватлыме гликозилфосфатидилинозитол дене иммобилизоватлыме белок-влак пеш кужу керамид липид ужаш дене чумыргеныт да специализироватлыме эндоплазме Net exit site-ыш шелалтыт, тидыже трансмембранный белок-влак дене пайдаланыме деч ойыртемалтеш. Тылеч посна, ме ончыктена, эндоплазматический ретикулум мембраныште керамидын шинчыр кужытшо тиде сортироватлыме селективностьлан кӱлешан. Мемнан шымлымашна икымше тура in vivo доказательствым пуа, липид шинчыр кужыт негызеш белок грузым секреторный корнышто ойырен налме экспорт верлашке классифицироватлаш.
Эукариотический клеткылаште эндоплазматический ретикулумышто (ЭР) синтезироватлыме белок-влакым секреторный корно дене транспортироватлыме годым келшыше клетке назначенийышкышт кондымо годым сортироватлат (1). Пальто дене кылдалтше сортироватлымаш деч посна, кужу жап шонен лукмо, южо липид-влак тыгак ойырен налме лекме вер семын служитлен кертыт, нуным ойыртемалтше мембране доменлашке чумырен, ойыртемалтше белок-влак (2-5). Туге гынат, тиде липид негызеш ыштыме механизмым пеҥгыдемдаш тура in vivo доказательстве эше уке. Тиде тӱҥ проблемым решатлаш манын, ме дрожжиште шымленна, кузе гликозилфосфатидилинозитол (ГПИ) анкерный белок-влак (ГПИ-АП) ER гыч дифференциальный экспортироватлалтыт. GPI-APs — тиде тӱрлӧ липид дене кылдалтше клетке ӱмбал белок ( 6, 7). ГПИ-АП — секретироватлыме белок, тудо плазме мембранын тӱжвал лышташыже-влак деке гликолипидный ужаш (ГПИ якорь) гоч пижын. Нуно GPI якорь-влакым ER люменыште консервативный посттрансляционный вашталтыш семын налыт (8). Ушымо деч вара ГПИ-АП Гольджи аппарат гоч (5, 9) ЭР гыч плазме мембраныш эрта. ГПИ-анкер-влакын улмышт ГПИ-АП-ым трансмембранный секретироватлыме белок деч (тидын шотыштак моло плазме мембранный белок деч) секреторный корно дене посна шупшыкташ таратен (5, 9, 10). Йӱштӧ клеткылаште GPI-AP-влак эндоплазматический ретикулумышто моло секретироватлыме белок деч ойыралтыт, вара шкешотан везикуллашке опталтыт, нуным ӱмбал белок комплекс II (COPII) дене пӱтырен шындат (6, 7). ER экспорт процессыште тиде классификаций процессын детерминантше-влак раш огытыл, но тиде механизмлан липид-влак кӱлын кертыт манын шонат, поснак GPI якорьын липид ужашыжым структурный ремоделироватлымаш (5, 8). Йӱштӧ годым ГПИ липид-влакын ремоделироватлымашышт ГПИ пижыктыме деч вара вигак тӱҥалеш, да шуко случайыште тудо керамидлан 26 углеродан кужу шинчыр дене шыҥдаралтше жирный кислота (С26:0) дене кылым ышташ амалым ышта (11, 12). C26 керамид — тиде дрожжевой клетке-влакын ыштыме тӱҥ керамид. Тудо ER-ыште синтезироватлалтеш да шукыжо COPII везикул гоч Гольджи аппаратыш колталтеш (13). GPI-AP-ын ER экспортшо лӱмынак умбакыже керамид синтезым йодеш (14, 15), а шке черетыштыже, Гольджи аппаратыште керамид гыч инозитол фосфат керамидыш (IPC) савырнымаш GPI анкер синтез деч шога (16). Искусственный мембране дене биофизический шымлымаш ончыктен: пеш кужу ацил шинчыр керамид-влак шкешотан физический свойствыж дене радамлыме домен-влакым ышташ ушнен кертыт (17, 18). Тиде данный-влак тыгай гипотезыш конда: C26 керамид ден GPI-AP C26 керамид дене шке физический свойствыштым радамлын але ER мембранный липидный средаште тыглай регионлашке але регионлашке ушнаш кучылтыт. Тӱҥ шотышто тудо кӱчык да тичмаш огыл глицеролипид-влак гыч шога (C16:1 да C18:1) (19, 20). Тиде регион-влак ойыртемалтше ER лекме верлашке (ERES) ойырен налме лийыт, кушто керамид ден керамид негызеш ыштыме GPI-AP-ым икгай COPII везикулышто Гольджи деке пырля шупшыкташ лиеш (5).
Тиде шымлымашыште ме тиде липид негызеш ыштыме механизмым тура тергенна, суперразрешениян конфокальный реальный жапыште сӱретлыме микроскопий (SCLIM) дене пайдаланен, тиде — эн ончыл микроскопий техник, тудо ик жапыште флуоресцентный палемдыме белок-влакым эскерен кертеш. Кум тӱсан да кум мер (3D) сӱрет-влак илыше клеткылаште моткоч кугу разрешениян да писын улыт (212).
Ме эн ончыч SCLIM технологийым кучылтынна, умбакыже рашемдаш манын, кузе тыглай GPI-AP C26 керамид группо дене S. cerevisiae-ште ER гыч лекмеке, трансмембранный секретироватлыме белокла гыч скринингым эртареныт. ER-ын классификацийжым тергаш манын, ме генетический системым кучылтынна, тудо in vivo ERES-ыш пурышо у синтезироватлыме грузым тура ончыктен кертеш (7, 23). Груз семын ме ойырен налынна C26 керамид негызеш GPI-AP Gas1, шем флуоресцентный белок дене палемдыме (GFP) да трансмембранный секретироватлыме белок Mid2, лишыл инфракрасный флуоресцентный белок дене палемдыме (iRFP), коктынат плазме мембране ӱмбаке таргетингым ыштат (24–26). sec31-1 температурлан шижше мутантыште нине кок грузым галактоза дене тарватыме промотор да конститутивный ERES маркер йымалне экспрессироватлат. Экстремальный температур годым (37°C), вет sec31-1 мутация COPII леведыш компонент Sec31 функцийым локтылеш, COPII шыҥдаралтмашым да ER экспортым тормозитлаш манын, у синтезироватлыме груз ER-ыште погына (23). Изи температур марте (24°C) йӱштӧ деч вара sec31-1 мутант клетке-влак секреторный область гыч лектыныт, да погынышо у синтетике грузым ER гыч лукташ тӱҥалыныт. CLIM визуализаций ончыктен, мом шукыжо у синтезироватлыме Gas1-GFP да Mid2-iRFP эше погынен ER sec31-1 мутант клетке-влак деч вара инкубаций 37°C да вара 24°C 5 минут жапыште луктын (рис 1). Mid2-iRFP пӱтынь ER мембраныште шарлен, а Gas1-GFP ER мембраныште ойыртемалтше кумдыкышто чумырген да погынен, сандене нунын шарлымышт моткоч вес тӱрлӧ (1-ше рис., А гыч С марте да S1 фильм). Тылеч посна, 1D рисыште ончыктымо семын, Gas1-GFP кластерыште Mid2-iRFP уке. Тиде лектыш ончыкта, молан манаш гын, GPI-AP да трансмембранный белок-влак тӱрлӧ ER мембранный регионлашке ондак шелалтыт. Gas1-GFP кластер mCherry-н COPII ӱмбал белок Sec13 дене палемдыме ойыртемалтше ERES дене лишыл (рис. 1, E да F, да S1 фильм) (23).
sec31-1 клетке-влак галактоза дене тарватыме секрет-влакым экспрессироватлат, кужу ацил шинчыр (C26) керамид GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, ужар) да трансмембранный белок Mid2-iRFP (TMP, кок) да тиде Конструктивный ERES маркироватлымаш Sec13-mCherry (E) 30°C-лан инкубироватлалтеш, минут, 24°C марте кусарыме, да 5 минут гыч SCLIM дене сӱретлыме. (А гыч С марте) самолётын представительный ушнышо але ик 2D сӱретшым ончыкта (А), 10 z-секций гыч 2D проекций сӱретым (В) але грузым да ERES маркер-влакын 3D клетке полушарийын сӱретшым (С). Шкала 1 мкм (А да В). Шкала единице 0,551 мкм (С). Gas1-GFP дискретный ER регионлаште але кластерлаште палемдалтын, а Mid2-iRFP палемдалтын да ER мембране мучко шарлен (C). (D) Графикыште ош стрелке линий дене (шолаште) Gas1-GFP кластерыште Gas1-GFP ден Mid2-iRFP-ын относительный флуоресценцийышт ончыкталтеш. АУ, произвольный единице. (E да F) 3D сӱретым ончыктат, тудо сатум да ERES пале-влакым ушен шога. Gas1-GFP кластер-влак ойыртемалтше ERES воктене палемдалтыныт. Шкала единице 0,551 мкм. (F) Ош пеҥгыде окна ERES дене кылдалтше Gas1-GFP кластерым палемда. Кокла да пурла панельыште ушнышо кугемдыме 3D-сӱретым да ойырен налме Gas1-GFP кластерын пӧрдмӧ койышыжым ончыктат.
Gas1-GFP кластер ден ойыртемалтше ERES коклаште лишыл пространственный кыл ончыкта, Gas1-GFP ойырен налме ERES пурен кертеш, тидыже Mid2-iRFP-ын ER гыч лекташ кучылтмо ойырен налме деч ойыртемалтеш. Тиде йӧным кораҥдаш манын, ме ик але кок сатулан гына ERES коэффициентым шотлен луктынна (2-шо рис, А гыч С марте). Ме пален нална, эн шуко ERES (70%) ик типлан гына грузым куча. Ӱлыл сӱретыште 2С рис кок тыглай примерым ончыкта ERES гына Gas1-GFP (рис 1) але гына Mid2-iRFP (рис 2). Вашталтышлан, иктаж 20% ERES кок грузым куча, нуно ик кумдыкышто ваш пернат. Палемдыме, южо ERES (10%) кок тӱрлӧ грузым куча, но нуно раш тӱрлӧ верыште ойыреныт. Сандене тиде статистике анализ ончыкта, молан манаш гын, ER экспортироватлыме деч вара, GPI-AP Gas1-GFP да трансмембранный груз Mid2-iRFP тӱрлӧ ERES-лан шелалтыт (рис. 2D). Тиде сортироватлыме пайдалык ончычсо биохимический анализ (6) да морфологический рашемдыме (7) дене пеш келшен толеш. Тыгак ме ERES-ыш пурышо карантинысе грузын койышыжым эскерен кертына (2Е рис. да S2 фильм). 2Е рис ончыкта, Gas1-GFP (3-шо панель) але Mid2-iRFP (4-ше панель) изи ужашыже гына ERES-ыш ик могыр гыч пура да ойыртемалтше кумдыкышто локтылалтеш. 2Е рис. 5-ше панельыште ончыктымо, Gas1-GFP да Mid2-iRFP южгунам ик ERES-ыште вашлиялтыт, но нуно тӱрлӧ могыр гыч пурат да тӱрлӧ COPII везикулым ончыктен кертше посна регионлаште чумыргеныт. Ме тыгак пеҥгыдемденна, мом эскерен ойырен да классифицироватлаш C26 керамид-негызеш GPI-AP Gas1 ойырен налме ERES семын ойыртемалтше, молан манаш гын, вес трансмембранный секреций груз, GFP-тег плазме мембране белок Axl2 (27 ), ончыкта, тыгаяк койыш Mid2-iRFP. (S1 сӱрет да S3 фильм). У синтезироватлыме Axl2-GFP ER мембране гоч шарлен, кузе Mid2-iRFP (рис. S1, А да В), да эн ERES-ыште Mid2-iRFP дене пырля верланен (рис. S1, B гыч D марте). 1-ше рис. 1-ше да 2-шо панель-влак. S1C ERES-ын кок тыглай примерыжым ончыкта, кушто кок трансмембранный груз ваш пернат. Тыгай годым кок сатум пырля ERES-ыш пуртат (рис. S1E, 3-шо панель да S3-шо фильм).
sec31-1 клетке-влак, галактоза индукций секрет-влакым, Gas1-GFP (GPI-AP, ужар) да Mid2-iRFP (TMP, шем) да конститутивный ERES маркироватлымаш Sec13-mCherry (ERES, пурпур) 37 °C 30 минут жапыште инкубаций деч вара 24 °C, 24 секрет марте куснаш да ионым блокироватлаш вераҥдыме SCLIM дене 20 минут гыч. (А гыч С марте) 2D проекций сӱрет-влак (А; масштаб бар, 1мкм) але 3D клетке полушарий сӱрет-влак (В да С; масштаб единице, 0,456мкм) грузым да 10 z-секцийым ERES дене палемдыме. (B) йымалне панельыште да (C) панельыште обрабатыватлыме сӱрет-влакым ончыктат, ERES (пурпур) [Gas1-GFP (шем) да Mid2-iRFP (йошкар-кӱшыл)] сатум гына ончыктат. (C) Почылтшо окна: ERES ик грузым гына нумалеш (1 гыч 4 марте). Сер окна: ERES ойырен налме грузым (5) куча. Ош пеҥгыде окна: ERES, тушто пырля верланыше груз уло. Тӱшка: Ойырен налме ик ERES-ыште Gas1-GFP (1) але Mid2-iRFP (2) гына улыт. Шкаланже, 100 нм. (D) (C)-ште ончыктымо фотомикрографийын чотшым шотлымаш. ERES-ын кокла процентше, кудыжо ик грузым гына (Gas1-GFP але Mid2-iRFP), ойырен налме грузым да ваш перныше грузым куча. Кум посна экспериментыште 54 клеткыште n=432. Йоҥылыш лаштык = SD. Кок могырым пардыме t-тест. *** P = 0,0002. (Е) 3D сӱрет ойырен налме ERES карантин грузым палемдыме (C). Gas1-GFP (шем) (3) але Mid2-iRFP (кӱшыл) (4) ик могыр гыч ERES (пурпур) пура да ERES кӧргыштӧ изи кумдык дене гына чак кылдалтын. Южгунам кок тӱрлӧ груз ик ЭРЭС-ыш (5) ик могыр гыч пурат да ЭРЭС кӧргыштӧ ойыртемалтше верыште локтылалтыт. Шкаланже, 100 нм.
Умбакыже ме тыгай гипотезым тергенна: кужу ацил шинчыр керамид (С26) ER мембраныште улшо Gas1-ын ойыртемалтше кластеризацийжым да сортироватлымашыжым ойырен налме ERES-ыш виктарен шога. Тидлан ме вашталтыме дрожжевой штаммым GhLag1 кучылтынна, кушто кок эндогенный керамид синтазым Lag1 ден Lac1 GhLag1 (хлопкын Lag1 гомологшо) дене алмаштеныт, тидын дене дрожжевой штамм лектын, тудын клетке мембране Ceramide штаммже чодыра тип деч кӱчыкрак лийын (рис. 3А) (288). Масс-спектрометрий (МС) анализ ончыктен: чодыра тип штаммлаште чумыр керамид гыч 95% пеш кужу (C26) шинчыр керамид, а GhLag1-ыште 85% керамид пеш кужу (C18 да C16). ), 2% гына керамид пеш кужу (С26) шинчыр керамид. С18 да С16 керамид-влак GhLag1 мембраныште тыгай жап марте палемдыме тӱҥ керамид улыт гынат, МС анализ тыгак пеҥгыдемден: GhLag1 штаммыште экспрессироватлыме Gas1-GFP-н GPI-анкерже C26 керамид уло, тудо чодыра тип липид дене таҥастараш лиеш. Качествыже икгай (рис. 3А) (26). Сандене тиде ончыкта, молан манаш гын, керамид ремоделирование фермент Cwh43 C26 керамидлан пеш ойырен налме, 26-шо рисыште ончыктымо семын, тудо GhLag1 штаммыште C26 керамид гыч изирак кугыт гыч GPI якорьым утларак пурта. S2 (29). Туге гынат, GhLag1 клетке мембраныште тӱҥ шотышто C18-C16 керамид гына уло, а Gas1-GFP-ште эше C26 керамид уло. Тиде факт тиде штаммым ER-ыште мембранный церамидын ацил шинчыр кужытшо дене кылдалтше проблемым лӱмынак решатлыме идеальная ӱзгарым ышта. Классын да сортироватлыме гипотетический рольышт. Вара ме эн ончыч тыглай флуоресцентный микроскопий гоч C26 Gas1-GFP-ын GhLag1-ыште температурлан шижше мутант аллель дене sec31-1 кластерлаште погынен кертмыжым шымленна, кушто ER мембраныште Ceramide-ыште кужу (C18-C16) шинчыр гына уло (рис. 3). Ме эскеренна, мом sec31-1, утларакше Gas1-GFP кластерыште чумырген, а Gas1-GFP sec31-1 GhLag1 кужу (C18-C16) кужу керамид ER мембране дене тӱҥ шотышто кластеризация лийын огыл да шарлен In пӱтынь ER мембране. Рашрак каласаш гын, молан манаш гын, C26 керамид негызеш кластеризация ойыртемалтше ERES дене чак кылдалтын (рис. 1), ме умбакыже шымленна, тиде процесс тыгак ER экспорт белок механизмын функцийжым ушнен кертеш мо. GPI-AP ER экспортлан посна COPII системым кучылтеш, тудо GPI якорьын гликан ужашыжым Ted1′s структур ремоделироватлымаш дене чолга регулироватлалтеш (30, 31). Рекомбинантный GPI-гликан вара трансмембранный грузым рецептор p24 комплекс дене палыме лиеш, тудо шке черетыштыже Lst1-ым ойырен налеш, тудо тӱҥ COPII грузым ушышо субъединице Sec24-ын ойыртемалтше изоформыжо, GPI-AP-лан поян COPII-м ышта. Везикул-влак кӱлыт (31-33). Сандене ме кок пачаш мутант чоҥышна, тудо нине ик белок-влакын (p24 комплекс компонент Emp24, GPI-гликан ремоделирование фермент Ted1 да ойыртемалтше COPII субединица Lst1) sec31-1 мутант штамм дене кораҥмашым ушен, да нуным шымленна. Ме эскеренна, мом sec31-1emp24Δ да sec31-1ted1Δ, Gas1-GFP тӱҥ шотышто некластерный да ER мембраныште шарлен, кузе ончыч ужын sec31-1 GhLag1, а sec31-1lst1Δ, Gas1-GFP гай sec31-11. Тиде лектыш ончыкта, молан манаш гын, ER мембраныште C26 керамид улмо деч посна, Gas1-GFP-н кластеризацийже тыгак p24 комплекс дене кылдалтшаш, да Lst1-ын ойыртемалтше вербовкажым ок йод. Вара ме ER мембраныште керамидын шинчыр кужытшо Gas1-GFP-ын p24 дене кылдалтмыжым регулироватлаш йӧным шымленна. Туге гынат, ме пален нална, молан манаш гын, мембраныште C18-C16 церамидын улмыжо p24 комплекс дене реконструироватлыме GPI-гликан-влаклан (рис. S3 да S4, А да В) але GPI-AP дене кылдалтмашлан да GPI-AP-ым экспортироватлымашлан ок локтыл. жөндөмдүүлүк. COPII Lst1 подтипым налза (рис. S4C). Сандене, C26 керамид деч шога кластеризация тӱрлӧ ER экспорт белок механизм дене белок вашкыл ок кӱл, но липид кужыт дене виктаралтше альтернативный сортироватлымаш механизмым поддержатла. Вара ме лончылена, ER мембраныште керамид ацил шинчыр кужытшо Gas1-GFP-ым ойырен налме ERES семын пайдалын классифицироватлаш кӱлешан мо. Кӱчык шинчыр керамид дене GhLag1 штаммыште Gas1 ER гыч лектын да плазме мембраныш пура (рис. S5), ме ӱшанена, сортироватлымаш керамид ацил шинчыр кужыт дене виктаралтеш гын, GhLag1 штаммыште Gas1 вес могырым кусарыме да ӱчашен кертеш. ЭРЭС сатум икгай мембране дене.
(А) GhLag1-ын клетке мембраныштыже тӱҥ шотышто кӱчыкрак C18-C16 керамид-влак улыт, а Gas1-GFP-н GPI-анкерже чодыра тип клетке-влак семынак C26 IPC-н эшеат уло. Ӱлнӧ: масс-спектрометрий (МС) дене дикий тип (Wt) да GhLag1p штамм-влакын клетке мембраныштышт керамидын ацил шинчыр кужытшым лончылымаш. Данный-влак чумыр керамид процентым ончыктат. Кум посна экспериментын кокла шотшо. Йоҥылыш лаштык = SD. Кок могырым пардыме t-тест. **** P ＜0,0001. Тӱшка панель: МС анализ ацил шинчыр кужытшо IPC улшо Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI якорь дикий тип да GhLag1p штамм-влак дене экспрессироватлалтеш. Данный-влак чумыр IPC сигналын процентшым ончыктат. Вич посна эксперимент кокла шот дене. Йоҥылыш лаштык = SD. Кок могырым пардыме t-тест. нс, кӱлешан огыл. P = 0,9134. (B) sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ да sec31-1lst1Δ клетке-влакын флуоресценций микрографийышт, галактоза дене тарватыме Gas1-GFP экспрессирующий, 37°C температурышто 30 минут жапыште инкубироватьленыт да флуоресценцийым волтеныт 24°C деч вара микроскопий. Ош окна: ER Gas1-GFP кластер. Почылтшо окна: Некластерный Gas1-GFP уло ER мембраныште шарлен, ER характеристикым ядерный йыҥгыр окрашивание ончыкта. Шкаланже, 5 мкм. (C) (B)-ште ончыктымо фотомикрографийын чотшым шотлымаш. Пунктат Gas1-GFP структур дене клетке-влакын кокла процентышт. Кум посна экспериментыште n≥300 клетке. Йоҥылыш лаштык = SD. Кок могырым пардыме t-тест. **** P ＜0,0001.
Тиде проблемым тура решатлаш манын, ме GhLag1-ыште Gas1-GFP ден Mid2-iRFP-ын SCLIM-визуализацийыштым sec31-1 температурлан шижше мутант аллель дене эртаренна (4-ше рис да S4 фильм). ER 37°C температурышто кучымо да вара 24°C температур годым лукмо деч вара, у синтезироватлыме Gas1-GFP шукыжо тыглай микроскоп дене эскерыме семын, ER мембране мучко чумырген да шарлен огыл (4-ше рис., А да В ). Тылеч посна, ERES-ын кугу ужашыже (67%) тушто пырля верланыше кок тӱрлӧ грузым пурта (4D рис.). 4С рис 1 да 2 панель-влак ERES-ын кок тыглай примерыжым ончыктат, нунын коклаште Gas1-GFP ден Mid2-GFP ваш тӱкнат. Тылеч посна, кок сатум икгай ERES-ыш налме (4Е рис., 3-шо панель да S4 фильм). Сандене мемнан лектышна ончыкта: ER мембраныште керамид ацил шинчыр кужытшо ER белокын чумыргымашыже да классификацийже кӱлешан детерминантлан шотлалтеш.
Sec31-1 GhLag1 клетке-влак, галактоза дене тарватыме секрет-влакым, Gas1-GFP (GPI-AP, ужар) да Mid2-iRFP (TMP, шем) да конститутивный ERES-палемдыме Sec13-mCherry (ERES, пурпур) экспрессирующий 37°C инкубировать. минут жапыште умбакыже шуяш, 24°C марте волташ, секрет-влакым лукташ, да 20 минут гыч SCLIM дене сӱретлаш. (А гыч С марте) 2D проекций сӱрет-влак (А; масштаб бар, 1мкм) але 3D клетке полушарийын сӱретше-влак (В да С; масштаб единице, 0,45мкм) 10 z-секцийыште, грузым да ERES дене палемдыме. (B) йымалне панельыште да (C) панельыште обрабатыватлыме сӱрет-влакым ончыктат, ERES (пурпур) [Gas1-GFP (шем) да Mid2-iRFP (йошкар-кӱшыл)] сатум гына ончыктат. (C) Ош темше окна: ERES, сатум ваш тӱкнымӧ. Почылтшо стрелке: ERES-ыште ик элемент гына уло. Ӱлыл панель: Ойырен налме ERES-ыште (C) дене палемдыме ваш тӱкнышо сатум (1 ден 2) уло. Шкаланже, 100 нм. (D) (C)-ште ончыктымо фотомикрографийын чотшым шотлымаш. sec31-1 да sec31-1 GhLag1 агрегатлаште ик грузым (Gas1-GFP але Mid2-iRFP) гына пуртымо, а ойырен налме грузлан да ваш перныше грузлан ERES-ын кокла процентше. Кум посна экспериментыште 54 клеткыште n = 432 (sec31-1) да 47 клеткыште n = 430 (sec31-1 GhLag1). Йоҥылыш лаштык = SD. Кок могырым пардыме t-тест. *** P = 0,0002 (сек31-1) да ** Р = 0,0031 (сек31-1 GhLag1). (E) 3D-сӱрет ойырен налме ERES-ын ӱмбалныже улшо груз дене (3) (C) дене палемдыме. Gas1-GFP (шем) да Mid2-iRFP (кӱшыл) ик могыр гыч ERES (пурпур) деке лишемыт да ик ERES ограничительный кумдыкышто кодыт. Шкаланже, 100 нм.
Тиде шымлымаш тура in vivo доказательствым пуа, липид негызеш ыштыме белок грузым секреторный корнышто ойырен налме экспорт верлашке шеледалтеш, да классификаций селективностьлан ацил шинчыр кужыт кӱлешлыкшым почын пуа. SCLIM манме куатле да ончыл микроскопий йӧн дене пайдаланен, ме у синтезироватлыме Gas1-GFP (тӱҥ плазме мембране GPI-AP пеш кужу ацил шинчыр (C26) керамид липид ужаш дене) дрожжиште ончыктенна) Дискретный ER-лаште чумыргышо регион-влак EERRES-ыште ойыртемалтше трансмембранный белок-влак дене кылдалтыныт, а ERRES мембране гоч секретироватлалтыт (1-ше рис). Тылеч посна, нине кок тӱрлӧ сату тӱрлӧ ЭРЭС-ыш ойырен пура (2-шо рис). Мембраныште улшо клетке керамидын ацил шинчыр кужытшо C26 гыч C18-C16 марте иземеш, Gas1-GFP кластер дискретный ER регионыш пудырген, а Gas1-GFP тыгаяк ERES гоч трансмембранный белок дене ER гыч лекташ куснен (3-шо да 3-шо рис.). 4).
GPI-AP ER гыч лекташ специализироватлыме белок механизмым кучылтеш гынат, ме пален нална: C26 керамид деч шога ойыркалымаш дифференциальный белок вашкыллан ок ӱшане, тидыже ERES специализацийыш конден кертеш (рис. S4 да S5). Олмеш, мемнан лектышна альтернативный классификаций механизмым пеҥгыдемда, тудо липид негызеш белок-влакын чумырген шогымышт да варажым моло грузым лукмаш дене виктаралтеш. Мемнан эскерымашна ончыкта, Gas1-GFP регион але кластер, ойыртемалтше ERES дене кылдалтше, трансмембранный секретироватлыме белок Mid2-iRFP уке, тидыже ончыкта, C26 керамид деч шога GPI-AP кластер нунын кӱлешан ERES-ыш пураш йӧным ышта, да тыгодымак трансмембранный секрет-влак тиде ойыртемалтше ERES-ыш пурат (2-шо рис. да 2-шо рис.). Вашталтышлан, ER мембраныште C18-C16 керамид-влакын улмышт GPI-AP-ым регион але кластер-влакым ышташ ок тарате, сандене нуно икгай ERES-ыш трансмембранный секретироватлыме белок-влакым огыт лук але алмаштат (3-шо да 4-ше рис.). . Сандене ме темлена, молан манаш гын, C26 керамид ойырен налме да классификацийым виктарен, ойыртемалтше ERES дене кылдалтше белок-влакын кластеризацийыштым куштылемдаш полша.
Кузе тиде C26 керамид деч шога кластеризацийым ойыртемалтше ER областьыш шукташ? Мембранный керамидын ӧрдыжкӧ ойырлаш тенденцийже GPI-AP ден C26 керамидлан кӱчыкрак да ненасыщенный глицеролипид-влакым налше ER мембранын утларак нерегулярный липидный средаштыже изи да вигак радамлыме липид-влакым ышташ амалым ыштен кертеш. Качестве кластер-влак (17, 18). Тиде изи жаплан лийше кластер-влак p24 комплекс дене кылдалтме деч вара умбакыже кугурак, пеҥгыдырак кластерлашке ушнен кертыт (34). Тидын дене келшышын, ме ончыктенна, молан манаш гын, C26 Gas1-GFP p24 комплекс дене кылым кучаш кӱлеш, кугурак коеш кластер-влакым ышташ манын (рис. 3). p24 комплекс — тиде гетерозиготный олигомер, тудо дрожжиште (35) куд тӱрлӧ p24 трансмембранный белок гыч шога, тудо шуко валентный ушымашым пуа, тидыже изи GPI-AP кластер-влакын ваш-ваш ушнымышт деке конден кертеш, тыге кугурак Стабильный кластерым ышта (34). GPI-AP-влакын белок эктодоменышт коклаште вашкыл тыгак нунын чумыргымашыштлан полшен кертеш, кузе нунын млекопитающий поляризоваться эпителиальный клеткылаште Гольджи транспорт годым ончыктымо (36). Туге гынат, кунам C18-C16 керамид ER мембраныште уло, кунам p24 комплекс Gas1-GFP дене кылдалтын, кугу посна кластер-влак огыт лий. Тӱҥ механизм кужу ацил шинчыр керамид ойыртемалтше физический да химий свойствыж деч шоген кертеш. Искусственный мембран-влакын биофизический шымлымашышт ончыктат: кужу (C24) да кӱчык (C18-C16) ацил шинчыр керамид-влак фазный ойыркалымашым ыштен кертыт гынат, кужу ацил шинчыр керамид-влак (C24) гына кугу Кривизне да плёнкым вашталташ полшен кертыт. Ваш-ваш эҥертыме гоч (17, 37, 38). Ончыктымо, мом трансмембранный спираль TMED2, айдеме гомолог Emp24, ойырен вашкыл дене C18 керамид негызеш сфингомиелин цитоплазме лопкытшо (39). Молекулярный динамике (МД) моделироватлымашым кучылтын, ме пален нална: C18 да C26 керамид-влак Emp24 трансмембранный спиральын цитоплазменный лопкытшо йыр погынат, да нунын икгай йӧратымашышт уло (рис. S6). Палемдыман, тиде ончыкта, Emp24-ын трансмембранный спиральже мембраныште липид-влакын асимметричный шеледымашышкышт конден кертеш. Тиде млекопитающий-влакын клеткышт негызеш ыштыме пытартыш лектыш. Тыгаяк МД моделироватлымаш тыгак эфир липид-влакын улмыштым ончыкта (40) . Сандене ме шонен луктына, молан манаш гын, ER26 кок лопкытшо C26 керамид верысе пойдаралтын. Кунам люминальный лопкытлаште GPI-AP тура шуко валентный p24 дене кылдалтын да цитоплазменный лопкытлаште p24 йыр C26 керамид погынен, тудо шкеж дене пырля лийше белок агрегироватлымашым да мембранный кривизне пӱй гоч генерироватлалтеш (41), тидлан кӧра GPI-AP ERES-ын кӱкшӧ регионжо-влак деке лишыл дискрет регионлашке ойыралтеш, тыгак кӱкшӧ йыгырмут регион-влаклан полша ER мембране (42). Ончычсо отчет-влак темлыме механизмым пеҥгыдемденыт (43, 44). Плазме мембраныште олиголектин, патоген але антитела-влакын керамид негызеш ыштыме гликосфинголипид-влак (ГСЛ) дене шуко валентный кылдалтмышт кугу ГСЛ агрегацийым тарвата, фазный ойырлымашым кугемда да мембранын деформацийжым да интернализацийжым луктеш (44). Ивабучи да т.м. (43) Палемдыме, кужу (C24) но кӱчык огыл (C16) ацил шинчыр-влак улмо годым GSL лактозилцерамид дене кылдалтше шуко валентный лиганд кугу кластер-влакым ыштымашым да мембранный инвагинацийым тарватен, а листовко-влакыште цитоплазмыште Lyn-медиировать сигналым колтымо листовко-влак нейтрофил-влакын мужырышт дене вашталтеш.
Млекопитающий-влакын поляризоватлыме эпителиальный клеткылаштышт анти-Гольджи сетьын (ТГН) апикальный плазме мембране кӱкшыт марте концентрацийже ГПИ-АП-ым ойырен да сортироватлыме пашам виктарен шога (10, 45). Тиде агрегироватлымаш GPI-AP олигомеризаций дене виктаралтеш (36), но тудо тыгак дрожжиште мумо керамид шинчыр кужыт деч шоген кертеш. Млекопитающий GPI-AP эфир липид негызеш якорь уло гынат, да тудын химий структурыжо пеш кужу ацил шинчыр керамид деч пеш ойыртемалтеш, шукерте огыл эртарыме шымлымаш ончыктен: кок липид эволюций шотышто икгай физический да химий свойствым да функцийым (40). Сандене млекопитающий-влакын клеткыштышт эфир липид ужаш дрожжиште улшо С26 керамид дене икгай лийын кертеш, да тудын рольжо — мембраныште кужу шинчыр керамид дене кылым кучаш, GPI-AP агрегироватлымашым да сортироватлымашым кумылаҥдаш манын. Тиде йӧным эше тура тергаш кӱлеш гынат, ончычсо лектыш-влак пеҥгыдемдат: кужу ацил шинчыр церамидым Гольджи капыш шупшыктымаш цитоплазме кусарыме белок дене огыл, а дрожжи гай ГПИ-анкер-влакын синтезышт деч шога. Сандене эволюций консервативный механизм ик транспорт везикулышто пеш кужу ацил шинчыр керамид ден ГПИ-АП-ым (13, 16, 20, 46, 47) ойырен налын кертеш.
Йӱштӧ да млекопитающий поляризоваться эпителиальный клетке системыште, GPI-AP агрегироватлымаш да моло плазме мембранный белок деч ойырлымаш чыла клетке ӱмбаке шумешке лиеда. Паладино да молат. (48) муын, мом TGN млекопитающий поляризоваться эпителиальный клетке-влак, GPI-AP кластеризация GPI-APs апикальный плазме мембраныш ойырен налме классификацийлан веле огыл кӱлеш, но тыгак GPI-APs кластеризаций организацийым да тудын биологический активностьшым регулироватлымаш. Клетке ӱмбал. Йӱштӧ годым тиде шымлымаш ончыктен: ER-ыште C26 керамид деч шога GPI-AP кластер плазме мембраныште GPI-AP-ын кластер организацийжым да функциональный активностьшым регулироватлен кертеш (24, 49). Тиде модель дене келшышын, GhLag1 клетке-влак GPI ингибитор але препарат-влаклан аллергий улыт, нуно клетке пырдыжын целостностьшым локтылыт (28), да дрожжевой клетке-влакын ушнымаште проецироватлыме ӱлыл керамидын функциональный Gas1-GFP кластерже-влакын (49) кӱлешлыкышт G hLag1 клетке-влакын физиологический лектышышт лийын кертеш. GPI-AP йоҥылыш. Туге гынат, умбакыже тергымаш, клетке ӱмбалын функциональный организацийже липид кужыт негызеш сортироватлыме йӧн дене ЭР гыч программлыме лийын мо, мемнан ончыкылык шымлымашын темыже лиеш.
Тиде пашаште кучылтмо Saccharomyces cerevisiae штамм-влак S1 таблицыште ончыкталтыныт. MMY1583 да MMY1635 штамм-влак SCLIM илыше клетке-влакым сӱретлаш W303 фонышто чоҥалтыныт. Тиде штамм-влак, Sec13-mCherry-м флуоресцентный белок тег дене экспрессироватлыше, полимеразный шинчыр реакций (ПЦР) негызеш ыштыме йӧн дене pFA6a плазмид шаблон семын чоҥалтыныт (23). GAL1 промоторын контрольжо йымалне флуоресцентный белок дене палемдыме Mid2-iRFP экспрессирующий штамм тыге чоҥалтын. pKTiRFP-KAN вектор гыч iRFP-KanMx радамым ПЦР-амплификаций (E. O'Shea пӧлек, Addgene плазмид номер 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; шымлыме ресурс идентификатор (RRID): Addgene_64687) да endogenous Midgeneus C-termind-ыш пуртымо. Mid2-iRFP геном радамым амплификаций да GAL1 промоторыш клонироватлыме деч вара, тудо pRS306 интеграций плазмидын Not I-Sac I сайтышкыже интегрироватлалтеш. Лӱмын ыштыме плазмид pRGS7 Pst I дене линейный лийын, URA3 локусыш интегрироватлаш манын.
Gas1-GFP слитный ген центромер (CEN) плазмидыште GAL1 промоторын контрольжо йымалне экспрессироватлалтеш, тудо тыге чоҥалтын. Gas1-GFP радамым pRS416-GAS1-GFP плазмид гыч (24) (L. Popolo пӧлек) ПЦР дене амплификацийым ыштеныт да CEN плазмид pBEVY-GL LEU2 (C пӧлек) Xma I–Xho I сайтыш клонироватленыт. Миллер; Адген плазмид номер 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Лӱмын ыштыме плазмидлан pRGS6 лӱмым пуэныт. Axl2-GFP слитный ген тыгак pBEVY-GL LEU2 векторын GAL1 промоторжын контрольжо йымалне экспрессироватлалтеш, да тудын чоҥалтмыже тыгай. Axl2-GFP радамым pRS304-p2HSE-Axl2-GFP плазмид гыч (23) ПЦР дене амплификацийым ыштеныт да pBEVY-GL LEU2 векторын Bam HI-Pst I сайтышкыже клонироватленыт. Лӱмын ыштыме плазмидлан pRGS12 лӱмым пуэныт. Тиде шымлымашыште кучылтмо олигонуклеотид-влакын радамышт S2 таблицыште ончыкталтеш.
Штаммлан 0,2% аденин да 2% глюкоза [YP-декстроза (YPD)], 2% рафиноз [YP-рафиноз] поян дрожжевой экстракт белок p (YP) среда (1 % дрожжевой экстракт да 2% белок ept) ешареныт. (YPR)] але 2% галактоза [YP-галактоза (YPG)] углерод источник семын, але синтетике минимум средаште (0,15% дрожжевой азот негыз да 0,5% аммиак сульфат) кочкышлан кӱлшӧ келшыше аминокислота ден негызым ешараш, да 2% глюкоза (2% глюкоза) але минимум среда галактоза (синтетике галактоза минимум среда) углерод источник семын.
Реальный жапыште сӱретлыме годым температурлан шижше sec31-1 мутант клетке-влакым, GAL1 промотор йымалне конструкцийым экспрессироватлыше, YPR средаште 24°C температурышто йӱдым лог-фазе марте куштеныт. YPG-ште 24°C 1 шагат жапыште индукций деч вара, клетке-влакым SG-ште 37°C 30 минут жапыште инкубироватьленыт, вара 24°C-ыш кусареныт, секрет блок гыч луктыныт. Конканавалин А-м стекло слайдыште клетке-влакым пеҥгыдемдаш кучылтыныт да SCLIM дене сӱретленыт. SCLIM — тиде Olympus IX-71 инвертированный флуоресценция микроскоп ден UPlanSApo 100×1.4 числан диафрагме масляный линзе (Olympus), кугу писылык да кугу сигнал-шум отношений дене пӧрдшӧ диск конфокальный сканер (Yokogawa Electric), шкешотан спектрометр, интенсивный системе-влакын комбинацийышт (Hamamatsu Photonics) ×266.7 пытартыш кугемдымаш дене лупа системым да электрон-влакым шукемдыше заряд дене кылдалтше ӱзгар камерым пуэн кертеш (Hamamatsu Photonics) (21). Сӱретым налме пашам шкешотан программе (Yokogawa Electric) дене шуктат. 3D-сӱретлан ме шке ыштыме пьезоэлектрический приводым кучылтынна, тудо объективым вертикальысе вибраций дене вибрироватленна, да оптике ужаш-влакым 100 нм тораште стекашке погенна. Z-стека сӱрет 3D воксель данныйыш савырна, а пӧрдмӧ диск конфокальный микроскоплан кучылталтше теоретический точко шарлыме функцийым Volocity программе (PerkinElmer) дене деконволюций обрабатыватлымашлан кучылтыт. Volocity программе дене пайдаланен, пырля верланыме верым лончылымашлан автоматически порогым ышташ манын, грузым пуртымо ERES-ым висыме. Линий сканироватлымаш анализ MetaMorph программе полшымо дене ыштыме (Molecular Devices).
Статистике значенийжым рашемдаш GraphPad Prism программе дене пайдаланаш. Кок могырым Студент t-тест да тыглай ик могырым дисперсий анализ (ANOVA) тестлан тӱшка коклаште ойыртем-влак P <0,05 (*) ӱмбаке кугу влиянийым ыштен шогат.
Gas1-GFP флуоресцентный микроскопийлан лог-фазный клетке-влакым YPD-ште йӱдым куштеныт да центрифугироватлыме дене погеныт, кок гана фосфат буферный физиологический раствор дене мушкыныт, лум ӱмбалне 15 минут деч шагал огыл инкубироватленыт, вара микроскоп йымалне ончыч ончыктымо семын умбакыже шуеныт Check (24). Налме годым объектив линзе, L5 (GFP) фильтр, Hamamatsu камера да Application Suite X (LAS X) программе дене пойдарыме Leica DMi8 микроскопым (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS) кучылтыныт. .
Образец-влакым 65°C 10 минут жапыште SDS образец буфер дене денатурироватлыме, вара SDS-полиакриламид гель электрофорез (PAGE) дене ойырен налме. Иммуноблоттинг анализлан кажне полосалан 10 мкл образецым оптеныт. Тӱҥ антитела: 1:3000 лукмаш дене коян поликлональный анти-Gas1, 1:500 лукмаш дене коян поликлональный анти-Emp24 да 1:3000 лукмаш дене коян поликлональный анти-GFP (H. Riezman деч пӧлек) кучылташ. Чыве моноклональный анти-Pgk1 антитела 1:5000 лукмаш дене кучылталтше (J. de la Cruz деч пӧлек). Кокымшо антитела: Хрен пероксидаза (HRP) конъюгированный каза анти-коян иммуноглобулин G (IgG) 1:3000 лукмаш дене кучылталтеш (Пирс). HRP-конъюгированный каза анти-чыве IgG 1:3000 лукмаш дене кучылталтше (Пирс). Иммунный вашмут зоным SuperSignal West Pico реагент (Thermo Fisher Scientific) химилюминесценций йӧн дене эскереныт.
(31)-ште ончыктымо семын, пойдаралтше ER фракцийыште пӱртӱс иммунопреципитаций экспериментым эртарыме. Кӱчыкын каласаш гын, дрожжевой клетке-влакым 600 нм ( OD600) 100 оптике плотность дене кок пачаш TNE буфер дене [50 мМ трис-HCl (рН 7,5), 150 мМ NaCl, 5 мМ EDTA, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид да протеаза ингибитор мешак) мушман. Тудым стекло шергаш дене пудыртеныт, вара клетке ломыж ден стекло шергаш-влакым центрифугироватлыме дене кораҥденыт. Вара ӱмбалым 17 000 г 15 минут жапыште 4°C температурышто центрифугироватлыме. Пеллетым ТНЭ-ште угыч шынденыт да 1% пытартыш концентраций марте дигиталис сапониным ешареныт. Суспензийым 1 шагат жапыште 4°C температурышто пӧрдын инкубироватленыт, вара 13 000 г 4°C температурышто 60 минут жапыште центрифугироватлыме дене эрыктыме огыл компонент-влакым кораҥденыт. Gas1-GFP иммунопреципитацийлан эн ончыч образецым яра агарозовый шергаш дене (ChromoTek) 4°C 1 шагат жапыште ончылгоч инкубировать, вара GFP-Trap_A (ChromoTek) дене 4°C 3 шагат жапыште инкубировать. Иммунопреципитированный шарик-влакым 0,2% дигоксигенин дене ТНЭ дене вич гана мушмо, SDS образец буфер дене элюироватлыме, SDS-PAGE дене ойырен налме да иммуноблоттинг дене лончылымо.
(31)-ште ончыктымо семын, пойдаралтше ЭР фракцийыште сшивание рашемдымашым эртарыме. Кӱчыкын, пойдаралтше ER фракцийым 0,5 мМ дитиобис (сукцинимидил пропионат) дене инкубироватьленыт (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA; 20°C, 20 мин). Сшивание реакцийым глицин (50 мМ пытартыш концентраций, 5 минут, 20°C) ешарен пытареныт.
Ондак каласыме семын (50), дикий тип да GhLag1 штаммлаште керамидлан МС анализым эртарыме. Кӱчыкын каласаш гын, клетке-влакым 30°C температур годым YPD-ште экспоненциальный фазы марте (3 гыч 4 OD600 единице/мл) куштеныт, да 25×107 клеткым погеныт. Нунын метаболизмышт трихлоруксус кислота дене йӱлалта. Экстракций растворительым [этанол, вӱд, эфир, пиридин да 4,2 Н аммиак гидроксид (15:15:5:1:0,018 v/v)] да 1,2 нмоль кӧргӧ стандарт C17 керамид (860517, Avanti полярный липид) качествым кучылташ). Экстрактын йӱштӧ щелочной гидролизшым ышташ монометиламин реагентым [метанол, вӱд, н-бутанол да метиламин раствор (4:3:1:5 об/об)] кучылтман, вара вӱд дене темше н-бутанолым шӧрым лукман. Пытартышлан, экстрактым положительный режимыште растворительыште [хлороформ/метанол/вӱд (2:7:1) + 5 мМ аммиак ацетат] угыч шыҥдареныт да масс-спектрометрыш пуртеныт. Сфинголипид молекул-влакым палемдыме да шотлымо шотышто шуко реакций мониторингым (МРМ) эртарыме. TSQ Vantage кумшо квадрупольный масс-спектрометр (Thermo Fisher Scientific) липид анализлан роботизированный нанопроточный ион источник Nanomate HD (Advion Biosciences, Итака, Нью-Йорк) дене пойдаралтын. Тӱкнымешке энергий кажне керамид категорийлан келыштарыме. МС данныйым позитивный режимыште налыныт. Кажне биологический репликлан липид сигнал кум посна висымашын медианыже улеш.
(31) семын ончыктымо, Gas1-GFP экспрессирующий клетке-влак (800×107) пӱртӱс иммунопреципитацийлан эҥертеныт. Эрыктен лукмо Gas1-GFP SDS-PAGE дене ойырен налме да поливинилиденфторид (PVDF) мембраныш кусарыме. Белокым ПВДФ-ым амид шем дене чиялтыме дене ончыктеныт. Gas1-GFP тасмам ПВДФ гыч луктыныт да 5 гана метанол дене да ик гана жидкостной хроматографий-МС (ЖХ-МС) сорт вӱд дене мушмо. Мембранный тасма дене 500 мкл 0,3 М NaOAc (рН 4,0), буфер да 500 мкл свежа эрыктыме 1 М натрий нитрит мешак дене 37°C 3 шагат жапыште инкубаций дене липид фракцийым Gas1-GFP гыч луктыт да лизироватлалтыт. (51). Тидын деч вара мембранный тасмам куд гана LC-MS сортан вӱд дене мушмо, пӧлем температур годым сушитлыме да анализ марте -80°C азот атмосферыште аралыме. Контроль семын кажне экспериментлан ПВДФ мембранын яра образецшым кучылтыныт. Gas1-GFP гыч лукмо липид вара MS дене лончылалтеш, кузе сӱретлалтеш (50). Кӱчыкын, ПВДФ тасма-влакым, кушто ГПИ-липид уло, 75 мкл отрицательный формо растворительыште [хлороформ/метанол (1:2) + 5 мМ аммиак ацетат] угыч шыҥдареныт да электроспрей ионизацийым (ЭСИ)-МРМ/МС сфинголипид вид-влакын анализыштым (TSQ Vantage) эртеныт. Тиде случайыште МС данныйым отрицательный ион режимыште налыныт.
Кузе ондак каласыме, липид ужаш GPI якорь деч ойырен [3H]-инозитол-палемдыме GPI-AP (16). Липид-влакым вичкыж лончан хроматографий дене ойыреныт, растворитель системым кучылтын (55:45:10 хлороформ-метанол-0,25% KCl) да FLA-7000 (Fujifilm) дене визуализироватленыт.
Gas1-GFP (600×107) экспрессироватлыше клетке-влакым TNE буфер дене TNE буфер дене кок гана мушмо, стеклошерст дене пудыртымо, вара клетке ломым да стеклошерстный ӱзгарым кораҥдаш центрифугироватлыме. Вара ӱмбалым 17 000 г 1 шагат жапыште 4°C температурышто центрифугироватлыме. Пеллетым ТНЭ-ште мушмо да 1 U PI-PLC (Invitrogen) дене ТНЭ-ште 0,2% дигиталис сапонин дене 37°C 1 шагат жапыште инкубироватьлыме. Фермент дене обрабатыватлыме деч вара мембраным 17 000 г 4°C 1 шагат жапыште центрифугироватлыме дене кораҥдыме. Gas1-GFP-ым иммунопреципитироватлаш манын, супернатант дене GFP-Trap_A (ChromoTek) 4°C температурышто йӱдым инкубироватьленыт. SDS-PAGE дене ойырен налме эрыктен лукмо Gas1-GFP-ым Coomassie бриллиант кок тӱсан дене чиялтеныт. Gas1-GFP чиялтыме тасмам акведук йыр улшо шем гыч ойыреныт, вара йодацетамид дене алкилироватлыме да дитиотреитол дене восстановлений деч вара трипсин дене гельыште йӱлалтымым эртареныт. Триптический пептид ден пептид-влакым GPI-гликан дене луктын да сушитлаш. Сухофруктовый пептид 20 мкл вӱдыштӧ эрыкталтын. LC-шке ужашым (8μl) пурто. Октадецилсилан (ODS) колонко (Develosil 300ODS-HG-5; кӧргӧ диаметрже 150 мм×1,0 мм; Nomura Chemical, Айти префектур, Японий) ойыртемалтше градиент условийыште пептид-влакым ойыраш кучылталтше. Мобильный фазыже — А растворитель (0,08% муравьиной кислота) да В растворитель (80% ацетонитрилыште 0,15% муравейник кислота). Accela ВЭЖХ системым (Thermo Fisher Scientific, Бостон, Массачусетс) 55 минут жапыште 50 мкл мин-1 йогын дене 5 минут жапыште А растворитель дене колонкым элюцийлан кучылтыныт, вара В растворительын концентрацийжым 40% марте кугемденыт. , США). Элюат ESI ион источникыш чарныде пуртымо, а GPI-гликан дене триптический пептид ден пептид-влакым LTQ Orbitrap XL (гибридный линейный ионный ловушка-орбитрап масс-спектрометр; Thermo Fisher Scientific) дене лончыленыт. МС настройкыште капилляр источникын напряженийже 4,5 кВ марте шындалтын, а кусарыме капилляр температур 300°C лийын. Капилляр напряжений да трубан линзе напряжений 15 В да 50 В марте шындалтыныт. МС данныйым 300/м/з масса/заряд коэффициент (м/з) 3000 массовый диапазонышто положительный ион режимыште (60 000 разрешений; 10 ужаш миллион) положительный ионный режимыште налыныт. МС/МС данныйым LTQ орбитыште ионный ловушко гоч налыныт [XL XL, данный-влак деч ончыч цифр-влак деч шога, тӱкнымешке тарватыме диссоциаций (CID)].
МД моделироватлымашым GROMACS (52) программе да MARTINI 2 вий аланыште (53-55) кучылтын ыштыме. Вара CHARMM GUI Membrane Builder (56, 57) диолеоилфосфатидилхолин (DOPC) да Cer C18 але DOPC да Cer C26 дене кок пачаш чоҥаш кучылталтше. Cer C26-ын топологийже да координатше-влак DXCE гыч сфингозин умша гыч ешартыш шарик-влакым кораҥдыме дене налме улыт. Кок пачаш баланслаш да тудым виктараш йымалне ончыктымо процессым кучылтман, вара системын пытартыш координатшым кучылтын, Emp24-ан системым чоҥаш. Трансмембранный домен дрожжевой Emp24 (173 гыч 193 марте кодеш) α-спираль семын чоҥалтын, кучылтмо визуальный МД (ВМД) инструмент молекулярный структур (58). Вара, ӱмбалне улшо липид-влакым кораҥдымеке, белокым тыгыде гранулироватлыме да CHARMM GUI дене пайдаланен, двуслойныйыш пуртымо. Пытартыш системыште 1202 DOPC да 302 Cer C26 але 1197 DOPC да 295 Cer C18 да Emp24 улыт. Системым 0,150 М концентраций марте ионизироватлаш. Кок двуслойный композицийлан куд посна репликым ыштеныт.
Липид двуслойный баланслаш CHARMM GUI процесс дене пайдаланен, тудо 405,000 ошкылым иземдаш да вара баланслаш, кушто койыш ограниченийым эркын-эркын иземдаш да кораҥдаш, да жап ошкылым 0,005 ps гыч 0,02 ps марте кугемдаш. Эквивалент деч вара тудо 6 мкс 0,02 пс жап ошкыл дене ыштен луктеш. Emp24 пуртымо деч вара, системым иземдаш да баланслаш тыгаяк CHARMM GUI процессым кучылтман, вара производствышто 8 с жапыште пашам ыштыман.
Чыла системылан балансироватлымаш процесс годым давленийым Берендсен баростат (59) виктарен шога, а производствышто давленийым Парринелло-Рахман баростат (60) виктарен шога. Чыла случайыште кокла давлений 1 бар да полуизотропный давленийым ушымо схемым кучылтыт. Баланс да производствышто термостат (61) дене писылык перекалибровка кучылталтеш, температурым ушымаште белок, липид да растворитель частице-влак шот дене. Пӱтынь паша жапыште цель температур 310К. Несвязывающий вашкыл 0,005 буфер чытымаш дене Верле схемым кучылтын, парный спискым ыштыме дене шотлалтеш. Кулон членым реакций аланыште да 1,1 нм тораште ойырен налме дене шотлат. Вандер Ваалсын терминже 1,1 нм тораште ӱлыл схемым кучылтеш, а Верле ӱлыл схемым потенциальный дрейфлан кучылтыт (62).
ВМД-м кучылтын, DOPC фосфат шергаш але керамид AM1 шергаш ден белок коклаште толкын кужытшо 0,7 нм, да белок дене кылым кучышо липид-влакын чотыштым шотлат. Тыгай формулым почеш, (63) семынак пытыме-поянлык (DE) факторым шотлыза: DE фактор = (0,7 белокышто чумыр липид-влакын чотышт) 0,7 белокышто (чылаже липидлаште Cer кугыт)
Отчет значений кокла шот дене налме, а йоҥылыш лаштык-влак SE-н куд посна копийже улыт. DE факторын статистический значенийжым t-тест дене шотлат [(averageDE-фактор-1)/SE]. Ик могырым шеледымаш гыч Р значенийым шотлыза.
GROMACS инструмент дене пытартыш 250 нс жапыште Emp24 улшо системын 2D ӧрдыж тыгыдылык картыжым шотлаш кучылталтше. Керамидын пойдаралтме/пытарыме картыжым налаш манын, Cer-ын тыгыдылык картшым Cer ден DOPC картын суммыштлан шеледалтеш, вара капыште Cer-ын концентрацийже дене шеледалтеш. Икгай тӱсан картын шкаланже кучылталтеш.
Тиде статьялан ешартыш материалым http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1
Тиде почылтшо статья, тудо Creative Commons Attribution-Non-Commercial License условий почеш шарлен, тудо кеч-могай йӧн дене кучылташ, шаркалаш да ешарен лукташ йӧным пуа, пытартыш кучылтмаш коммерческий пайдалан огыл гын да тӱҥ паша чын улмылан негыз уло гын. Ссылки.
Палемдыман: Ме тендан деч электрон почто адресым пуаш гына йодына, тыге еҥ, кудым тый лаштыкыш темлет, пала, мом те нунылан электрон почто ужаш шонеда да тиде спам огыл. Ме нимогай электрон почто адресым огына нал.
Тиде йодыш тендан унагудо улмыдам тергаш да автоматический спам колтымо деч аралаш кучылталтеш.
София Родригес-Галлардо, Казуо Курокава, Сюзанна Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксилиядора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес -Линерхио Серхопе (Серхопе) (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D кӱкшӧ разрешениян чын жапыште сӱретлымаш ойырен налме лектыш верлаште белокым сортироватлыме годым керамид шинчыр кужыт кӱлешлыкшым почын пуа.
София Родригес-Галлардо, Казуо Курокава, Сюзанна Сабидо-Бозо, Алехандро Кортес · Гомес (Алехандро Кортес-Гомес), Ацуко Икеда (Ацуко Икеда), Валерия Зони (Валерия Зони), Ауксилиядора Агилера-Ромеро, Ана Мария Перес -Линерхио Серхопе (Серхопе) (Михо Вага), Мисако Арман (Мисако Арман), Мияко Риман (Мияко Риман), Проу Акира, Стефано Фанни, Акихико Накано, Мануэль Мунис
3D кӱкшӧ разрешениян чын жапыште сӱретлымаш ойырен налме лектыш верлаште белокым сортироватлыме годым керамид шинчыр кужыт кӱлешлыкшым почын пуа.
©2020 Наукым вияҥдыме шотышто американ ассоциаций. чыла правам аралыме. AAAS — HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef да COUNTER-ын партнерышт. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.