Статья «Пакчасаска-влакын патоген ден вредитель-влаклан чытымашыштым саемдымаш» шымлыме теме ужашлан шотлалтеш, чыла 5 статьям ончалза
Грибковый кушкыл чер некрозын причинный агентше Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) де Бари тӱрлӧ оза кушкылым инфицироватлаш шуко кӱкшытан стратегийым кучылтеш. Тиде шымлымаш диамин L-орнитиным кучылташ темла, тиде белок огыл аминокислота, тудо моло кӱлешан аминокислота-влакын синтезыштым кумылаҥда, альтернативный управлений стратегий семын Phaseolus vulgaris L.-н Pseudomonatiotiorum scleromonias дене кылдалтше ош лышташлан молекулярный, физиологический да биохимический вашмутшым кугемдаш полша. In vitro эксперимент-влак ончыктеныт: L-орнитин S. pyrenoidosa-н мицелий кушмашыжым дозым шот дене ятырлан тормозитлен. Тылеч посна, теплицысе условийыште ош лышташын нелылыкшым ятырлан иземден кертеш. Тылеч посна, L-орнитин обрабатыватлыме кушкыл-влакын кушмашыштым кумылаҥден, тидыже L-орнитинын тергыме концентрацийже обрабатыватлыме кушкыллан фитотоксичный огыл улмым ончыкта. Тылеч посна, L-орнитин неферментный антиоксидант-влакын (пӱтынек растворимый фенолик ден флавоноид-влак) да ферментный антиоксидант-влакын (каталаза (CAT), пероксидаза (POX) да полифенол оксидаза (PPO)) экспрессийыштым кугемден, да кум антиоксидант дене кылдалтше ген-влакын (PSO1, PSO, PAVD, PAVD) экспрессийыштым кугемден. Умбакыже, in silico анализ S. sclerotiorum геномышто шотлымо оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH) белок улмым пален налын, тудо Aspergillus fijiensis (AfOAH) да Penicillium Penicillium-ын оксалоацетат ацетилгидролаза (SsOAH) белокышт дене пеш икгай лийын. (PlOAH) функциональный анализ, аралыме домен да топологий шотышто. Оҥай, пареҥге декстроза бульоныш (PDB) L-орнитиным ешарымаш S. sclerotiorum мицелийыште SsOAH генын экспрессийжым ятырлан иземден. Тыгак L-орнитиным экзогенный кучылтмаш обрабатыватлыме кушкыл гыч погымо грибковый мицелийыште SsOAH генын экспрессийжым ятырлан иземден. Пытартышлан, L-орнитин дене пайдаланыме дене PDB средаште да черланыше лышташыште щавелевый кислота секреций ятырлан шагалемын. Иктешлен каласаш гын, L-орнитин редокс статусым арален кодымаште, тыгак черланыше кушкыл-влакын аралыме вашмутыштым кугемдымаште тӱҥ рольым модеш. Тиде шымлымашын лектышыже ош лышташ дене кучедалаш да пырче да моло культурылан эҥгекым иземдаш инноваций, экологий шотышто пайдале йӧн-влакым ямдылаш полшен кертеш.
Ош лышташ, некротрофный грибок Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary дене кылдалтын, тиде лӱдыкшӧ, лектышым иземдыше чер, тудо тӱнямбал пырче (Phaseolus vulgaris L.) ыштен лукмашлан кугу лӱдыкшым ышта (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum — мланде ӱмбалне шарлыше грибковый кушкыл патоген-влак кокла гыч иктыже, тудым контрольышто кучаш, 600 утла кушкыл тӱрлӧ кумда оза спектр дене да оза ткань-влакым ойыртемалтше йӧн дене писын ыштен кертме йӧн дене (Liang and Rollins, 2018). Йӧнан огыл условийыште тудо шке илыш циклжын кӱлешан жапшым эрта, кужу жап мланде ӱмбалне шем, пеҥгыде, урлык гай структур семын, «склеротий» манме структур семын але черланыше кушкыл-влакын мицелийыштышт але лышташыштышт ош, пушкыдо кушмаш семын йӱлен кодеш (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum склеротийым ыштен кертеш, тидыже тудлан черланыше аланыште кужу жап илаш да чер годым аралалт кодаш йӧным пуа (Schwartz et al., 2005). Склеротий-влак кочкыш веществалан поян улыт, мланде ӱмбалне кужу жап аралалт кертыт, умбакыже инфекцийлан тӱҥ инокуляций семын служитлат (Schwartz et al., 2005). Сай условийыште склеротий-влак шыҥдаралтыт да кушкылын мланде ӱмбалсе чыла ужашыжым, тыгак пеледышым, лышташым але лышташым, инфицироватлен кертше юж дене лекше спорым ыштен луктыт (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum шке оза кушкыл-влакым инфицироватлаш шуко кӱкшытан стратегийым кучылтеш, склеротиальный шыҥдаралтме гыч тӱҥалын, симптом-влакын вияҥмышт марте радам дене келыштарыме событий-влакым ушештара. Тӱҥалтыште S. sclerotiorum апотеций манме мӱшкыр гай структурла гыч суспензированный спорым (аскоспора маныт) луктеш, нуно южышто лийыт да черланыше кушкыл ломыж ӱмбалне тарваныдыме склеротийыш савырнат (Bolton et al., 2006). Вара лышташ кушкыл клетке пырдыжын рН-жым виктараш, ферментный деградацийым да тканьыш шыҥдарымашым кумылаҥдаш, вирулентность факторым — щавелевый кислотам луктеш (Hegedus and Rimmer, 2005), да оза кушкылын окислительный лопкытшым локтылеш. Тиде кислотада процесс кушкыл клетке пырдыжым луштара, грибковый клетке пырдыжым пудыртышо фермент-влакын (CWDEs) тыглай да пайдале пашаштлан келшыше средам ышта, патогенлан физический барьерым сеҥаш да оза тканьлашке пураш йӧным пуа (Marciano et al., 1983). Ик гана пурен, S. sclerotiorum икмыняр CWDE-м секретироватла, мутлан, полигалактуроназа ден целлюлоза, нуно тудын черланыше тканьлаште шарлымыжым куштылемдат да ткань некрозым луктыт. Лезий ден гифальный мат-влакын вияҥмышт ош лышташын характерный палыже-влак деке конда (Hegedus and Rimmer, 2005). Тиде жапыште оза кушкыл-влак патоген дене кылдалтше молекулярный образец-влакым (ПАМФ) образец-влакым палыме рецептор-влак (ПРР) гоч палат, тидыже сигнал событий-влакын радамыштым тарвата, нуно мучашлан аралыме вашмутым тарватат.
Лу ий жапыште чер ваштареш кучедалме тыршымаш гынат, патогенын чытымашыже, илыше кодмыжо да келыштарыме улмыжлан кӧра, моло коммерческий культурышто семынак, пырчеште ситыше чытыше зародыш плазмын ситыдымашыже кодеш. Сандене чер дене кучедалмаш моткоч неле, тудо тӱвыра практикым, биологический контрольым да химий фунгицид-влакым ушен шогышо интегрироватлыме, шуко шӧрынан стратегийым йодеш (O'Sullivan et al., 2021). Ош лышташ дене химий йӧн дене кучедалмаш эн пайдале, вет фунгицид-влакым чын да жапыштыже кучылтмо годым чер шарлымым сайын кучен кертыт, инфекцийын нелылыкшым иземдат да лектышым йомдарымашым иземдат. Туге гынат, фунгицид-влакым чот кучылтмаш да нунылан чот ӱшанымаш S. sclerotiorum-ын чытыше штаммже-влакын лекмышт деке конден кертеш да цельдыме организм-влаклан, мландын тазалыкшылан да вӱдын качествыжлан уда могырым эҥгекым ышта (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Сандене экологий шотышто йӧнан альтернативым мумаш эн тӱҥлан шотлалтеш.
Полиамин-влак (ПА), мутлан, путресцин, спермидин, спермин да кадаверин, мланде ӱмбалне кушкыл патоген-влак ваштареш перспективный альтернатива семын служитлен кертыт, тыге лӱдыкшӧ химий фунгицидым кучылтмашым тӱрыснек але ужаш дене иземдат (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Кӱкшӧ кушкыллаште ПА-влак шуко физиологий процессыште участвоватлат, нунын коклаште, но тидын дене гына серлагаш огыл, клетке шеледымаш, дифференциаций, абиотический да биотический стресслан вашмут (Killiny and Nehela, 2020). Нуно антиоксидант семын выступатлен кертыт, реактивный кислород вид-влакым (ROS) лукташ полшат, редокс-гомеостазым арален кодат (Nehela and Killiny, 2023), аралыме дене кылдалтше ген-влакым тарватат (Romero et al., 2018), тӱрлӧ метаболический корным регулироватлат (Nehela and Killiny, 2023), эндогенофил да генгетомон-влакым модулироватлат (Nehela and Killiny, 2023) Киллини, 2019), системе налме торешланымашым (SAR) ышташ да кушкыл-патоген вашкылым регулироватлаш (Нехела ден Киллини, 2020; Асия да молат, 2022; Червониец, 2022). Палемдыман, кушкыл аралыме годым ПА-влакын ойыртемалтше механизмышт да рольышт кушкыл тӱрлык, патоген да йырым-йырысе среда условий деч шога. Кушкыллаште эн шуко ПА кӱлешан полиамин L-орнитин гыч биосинтезироватлалтеш (Killiny and Nehela, 2020).
L-орнитин кушкыл кушмаште да вияҥмаште шуко рольым модеш. Мутлан, ончычсо шымлымаш ончыктен: рисыште (Oryza sativa) орнитин азот перерабатыватлыме дене кылдалтын кертеш (Liu et al., 2018), рис лектыш, качестве да аромат (Lu et al., 2020), вӱд стресс вашмут (Yang et al., 2000). Тылеч посна, L-орнитиным экзогенный кучылтмаш сакыр пареҥге (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) йӱштӧ чытымашым ятырлан кугемден да лукышто (Allium Cepa) шӧр стрессым иземден (Çavuşoǧlu да Çavuşoǧlu, 2021) да cawcardium (Accidale) кушкыл Роча да молат, 2012). L-орнитинын абиотический стресс деч аралыме пашаште рольжо обрабатыватлыме кушкыллаште пролин погынымаште участвоватлымыж дене кылдалтын кертеш. Мутлан, пролин метаболизм дене кылдалтше ген-влак, мутлан, орнитин дельта аминотрансфераза (дельта-ОАТ) да пролин дегидрогеназа (ProDH1 да ProDH2) ген-влак, ончычсо семынак Nicotiana benthamiana ден Arabidopsis thaliana-н хозяин огыл Pseudomonas штамм-влак деч аралыме пашаште участвоватлымышт нерген увертареныт (Ss-S, Mysoreh 2012 ий). Вес могырым, грибковый орнитин декарбоксилаза (ОДК) патоген кушмашлан кӱлеш (Singh et al., 2020). Fusarium oxysporum f-ын ODC-жым таргетинг. сп. lycopersici хост-индуцированный ген-влакым шыпландарымаш (HIGS) гоч помидор кушкыл-влакын Fusarium wilt-лан чытымашыштым ятырлан кугемден (Singh et al., 2020). Туге гынат, фитопатоген гай биотический стресс ваштареш экзогенный орнитин кучылтмо рольым сайын шымлыме огыл. Эн тӱҥжӧ, орнитинын черлан чытымашлан эҥгекше да тудын дене кылдалтше биохимический да физиологический явлений-влак шукыж годым шымлыдыме кодыныт.
Пакчасаска-влакын S. sclerotiorum инфекцийыштын сложностьшым умылаш пайдале контроль стратегийым ыштымаште кӱлешан. Тиде шымлымашыште ме диамин L-орнитинын Sclerotinia sclerotiorum инфекций деч аралалтме механизмым да чытымашыжым кугемдымаште тӱҥ фактор семын рольжым палемдаш шоненна. Ме тыгай гипотезым ыштена: черланыше кушкыл-влакын аралыме вашмутыштым кугемдыме деч посна, L-орнитин тыгак редокс статусым арален кодымаште тӱҥ рольым модеш. Ме темлена, молан манаш гын, L-орнитинын кертме эффектыже ферментативный да неферментативный антиоксидантный аралыме механизм-влакым регулироватлыме да грибковый патогенность/вирулентность фактор-влак да нунын дене кылдалтше белок-влак дене мешая. L-орнитинын тиде кок функцийже тудым ош лышташын эҥгекшым иземдаш да тыглай пакчасаска культурын тиде виян грибковый патогенлан чытымашыжым кугемдаш ӱшанле стратегийлан ӱшанле кандидатлан ​​шотла. Кызытсе шымлымашын лектышыже ош лышташ дене кучедалаш да тудын пакчасаска лектышлан эҥгекым иземдаш инноваций, экологий шотышто йӧнан йӧн-влакым вияҥдаш полшен кертеш.
Тиде шымлымашыште экспериментальный материал семын тыглай пырче коммерческий сорт Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3) кучылталтше. Таза урлыкым поро кумылын пуэныт пакчасаска шымлыме пӧлка, пасу культур шымлыме институт (FCRI), ял озанлык шымлыме рӱдер (ARC), Египет. Парник условийыште (25 ± 2 °C, относительный вӱдыжгылык 75 ± 1%, 8 шагат волгыдо/16 шагат пычкемыш) S. sclerotiorum дене черланыше мланде дене темше пластик лончыш (внутренний диаметрже 35 см, келгытше 50 см) вич урлыкым ӱденыт. Ӱдымӧ деч вара 7-10 кече гыч (ДПС) ӱдымӧ ӱдымӧ ӱдымӧ ӱдымӧ ӱдымӧ кок ӱдымӧ гына икгай кушшо да кажне лончышто кум кумдаҥдыме лышташым гына коден. Чыла лончо кушкыллан кок арнялан ик гана вӱдым оптеныт да тылзе еда пуымо сортлан темлыме кугыт дене ӱяҥденыт.
L-орнитиндиамин (тыгак (+)-(S)-2,5-диаминопентановый кислота семын палыме; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германий) 500 мг/л концентрацийым ямдылашлан 50 мг эн ончыч 100 мл стерильный дистиллированный вӱдыштӧ эрыктыме. Вара стоковый растворым луктыныт да умбакыже экспериментлаште кучылтыныт. Кӱчыкын, шым серий L-орнитин концентраций (12,5, 25, 50, 75, 100, да 125 мг/л) in vitro тергеныт. Тылеч посна, стерильный дистиллированный вӱдым отрицательный контроль семын кучылтыныт (Мок) да коммерческий фунгицид «Ризолекс-Т» 50% вӱдыжгӧ порошок (токлофос-метил 20% + тирам 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Governorate, Egty) положительный контроль семын кучылталтше. Коммерческий фунгицидым «Ризолекс-Т» вич концентрацийыште (2, 4, 6, 8 да 10 мг/л) in vitro тергеныт.
Коммерческий озанлыкла гыч ош лышташын тыглай палыжым ончыктышо тыглай пырче лышташ ден лышташ-влакын образецыштым погеныт (10–30%). Инфицироватлыме кушкыл материал-влак кокла гыч шукышт тӱрлӧ/тӱрлык дене палемдалтыныт гынат (восприимчивый коммерческий тӱрлӧ Гиза 3), молышт, поснак верысе пазарла гыч налме-влак, палыдыме тӱрлӧ лийыныт. Погымо инфицироватлыме материалым ондак 0,5% натрий гипохлорит раствор дене 3 минут жапыште ӱмбалым дезинфицироватленыт, вара стерильный дистиллированный вӱд дене икмыняр гана мушмо да стерильный фильтр кагаз дене ӱштын, лишыл вӱдым кораҥдыме. Вара черланыше орган-влакым кокла ткань гыч (таза да черланыше ткань коклаште) изи ужашлан шеледеныт, пареҥге декстроза агар (ПДА) средаште куштеныт да 25 ± 2 °C температурышто 12 шагат волгыдо/12 шагат пычкемыш цикл дене 5 кече склеротийым ышташ кумылаҥденыт. Мицелий ӱлыл йӧн дене тыгак аралаш але лавыртыме культур гыч грибковый изолят-влакым эрыкташ кучылталтше. Эрыктен налме грибковый изолят эн ончыч тудын культур морфологический характеристикыже негызеш палемдыме, вара микроскопический ойыртемже негызеш S. sclerotiorum улмыжым пеҥгыдемдыме. Пытартышлан, чыла эрыктен лукмо изолят-влакым патогенность шотышто восприимчивый тыглай пырче сорт Гиза 3 дене тергеныт, Кохын постулатшым шукташ манын.
Тылеч посна, эн инвазивный S. sclerotiorum изолят (изолят #3) умбакыже пеҥгыдемдалтын, кӧргӧ транскрибироватлыме проставка (ITS) секвенирование негызеш, кузе сӱретлалтеш White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Кӱчыкын, изолят-влакым пареҥге декстроза бульонышто (ПДБ) куштеныт да 25 ± 2 °C 5-7 кече жапыште инкубироватленыт. Вара грибковый мицелийым погеныт, марля дене ӱштыныт, стерильный вӱд дене кок гана мушмо да стерильный фильтр кагаз дене сушитленыт. Геномный ДНК-м Quick-DNATM Fungal/Bacterial Miniprep Kit (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024) полшымо дене ойырен налме. Вара ITS рДНК регионым ITS1/ITS4 ойыртемалтше праймер пар дене амплификацийым ыштеныт (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; вучымо кугыт: 540 п.н.) ( Baturo-Ciesniewska et al., 2017 ). Эрыктен лукмо ПЦР продукт-влакым секвенирование (Пекин Аоке Диншенг Биотехнологий Ко., Лтд.) колтеныт. ITS рДНК-н радамже-влакым Сэнгер секвенирование йӧн дене кок могырым секвенироватлыме. Вара погымо йодмаш радам-влакым GenBank-ыште да Национальный рӱдерыште биотехнологий информаций (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) BLASTn программе полшымо дене пытартыш данный дене таҥастареныт. Йодыш радам дене таҥастареныт 20 моло S. sclerotiorum штамм/изолят, пытартыш данный гыч налме NCBI GenBank (Ешартыш таблице S1) кучылтмо ClustalW молекулярный эволюций генетике анализ пакет (MEGA-11; версия 11) (Kumar et al., 2024). Эволюций анализ эн кугу вероятность йӧн да чумыр жапыште пӧртылташ лийме нуклеотид алмаштышыже модель дене ыштыме (Nei and Kumar, 2000). Эн кугу лог-вероятность дене пушеҥге ончыкталтеш. Эвристический кычалмашлан тӱҥалтыш пушеҥгым лишыл ушнышо (НЖ) пушеҥге (Кумар да молат, 2024) да эн кугу парсимоний (МП) пушеҥге коклаште кугурак лог-вероятность дене пушеҥгым ойырен налме дене ойырен налме. Нью-Джерси пушеҥгым чумыр жап дене пӧртылташ лийме модель дене шотлымо парный торалык матрице дене ыштыме (Ней ден Кумар, 2000).
L-орнитин ден «Ризолекс-Т» бактерицидын антибактериальный активностьыштым in vitro агар диффузионный йӧн дене рашемдыме. Йӧн: L-орнитинын (500 мг/л) растворжым келшыше кугыт дене налын, 10 мл PDA кочкыш веществан среда дене сайын лугыза, пытартыш концентраций дене 12,5, 25, 50, 75, 100 да 125 мг/л растворым ямдылаш. Контроль семын «Ризолекс-Т» (2, 4, 6, 8 да 10 мг/л) фунгицидын вич концентрацийжым да стерильный дистиллированный вӱдым кучылтыныт. Среда пеҥгыдеммеке, 4 мм диаметран Sclerotinia sclerotiorum культурын свежа ямдылыме мицелий пробкыжым Петри тарелкын рӱдышкыже кусареныт да 25±2°C температурышто мицелий уло контроль Петри тарелкым леведмешке культурироватленыт, тидын деч вара грибковый кушмашым возен налме. 1-ше уравнений дене пайдаланен, S. sclerotiorum радиальный кушмашын процентный торможитлымыжым шотлыза:
Экспериментым кок гана эртареныт, кажне контроль/экспериментальный группылан шым биологический реплике да кажне биологический репликелан вич лончо (ик лончышто кок кушкыл) лийын. Кажне биологический репликым кок гана (кок технический репликым) лончыленыт, экспериментальный лектышын чынлыкшым, ӱшанлыкшым да воспроизводимостьшым ӱшандарыше. Тылеч посна, пробит регрессий анализ пел максимум тормозной концентрацийым (IC50) да IC99 (Prentice, 1976) шотлаш кучылталтше.
Теплицысе условийыште L-орнитинын куатшым аклаш манын, кок радам дене лончо экспериментым эртареныт. Кӱчыкын, лончо-влакым стерилизоватлыме кӱртньӧ мланде дене (3:1) теменыт да S. sclerotiorum-ын свежа ямдылыме культурыж дене инокулироватленыт. Икымше, S. sclerotiorum-ын эн инвазивный изолятшым (3-шо изолят) ик склеротийым кок ужашлан ӱштын, тудым КПК ӱмбаке ӱмбакыже пыштен да 25°C температурышто эре пычкемышыште (24 шагат) 4 кече жапыште мицелийын кушмашыжым кумылаҥдаш инкубаций дене куштеныт. Вара ончыл лук гыч 5 мм диаметран куд агар пробкым налыныт да 100 г стерильный шурно ден рис ӱй дене (1:1, v/v) инокулироватленыт да чыла колба-влакым 25 ± 2 °C температурышто 12 шагат волгыдо/12 шагат пычкемыш циклыште 5 кече жапыште инкубироватленыт, тыге склеротийым ышташ кумылаҥденыт. Мландым ешарыме деч ончыч чыла колба содержанийым сайын вашталтеныт, икгайлыкым ышташ манын. Вара кажне лончыш 100 г колонизироватлыше ӱйым ешареныт, тыге патоген-влакын эреак концентрацийышт лийже манын. Инокулироватлыме лончо-влакым грибковый кушмашым тарваташ вӱдым оптеныт да 7 кече жапыште теплицыш вераҥденыт.
Вара кажне лончыш «Гиза 3» сорт гыч вич урлыкым ӱденыт. L-орнитин да фунгицид Rizolex-T дене обрабатыватлыме лончо-влаклан стерилизоватлыме урлыкым ондак кок соединенийын вӱдышӧ растворыштыжо кок шагат жапыште пытартыш IC99 концентрацийже 250 мг/л да 50 мг/л наре лийын, вара ӱдымӧ деч ончыч ик шагат жапыште юж дене сушитленыт. Вес могырым, урлыкашым стерильный дистиллированный вӱдыштӧ отрицательный контроль семын йӱлалтеныт. Лу кече гыч, икымше вӱдым оптымо деч ончыч, нӧшмым вичкыжтеныт, кажне лончышто кок ару нӧшмым гына коденыт. Тылеч посна, S. sclerotiorum дене инфекцийым ӱшандарыше, икгай вияҥме стадийыште (10 кече) пырче кушкыл лышташым кок тӱрлӧ верыште стерилизоватлыме скальпель дене руэныт да кажне яра верыш иктаж 0,5 г колонизироватлыше отрубь ӱпшым пыштеныт, вара чыла чер дене черланыше кушкыл-влакын вияҥмыштым тарваташ кугу вӱдыжгылыкым ыштеныт. Контрольный кушкыл-влакым тыгак сусыргеныт да сусыр верыш икгай кугыт дене (0,5 г) стерильный, колонизироватлыдыме отрубь ӱпшым пыштеныт да кугу вӱдыжгылык йымалне кученыт, чер вияҥме средам моделироватлаш да эмлыме тӱшка коклаште келшымашым ышташ манын.
Обрабатыватлыме йӧн: пырче нӧшмым 500 мл вӱдышӧ раствор дене L-орнитин (250 мг/л) але фунгицид Rizolex-T (50 мг/л) дене мландым ӱяҥденыт, вара 10 кече жапыште кум гана обрабатыватленыт. Плацебо дене эмлыме контрольым 500 мл стерильный дистиллированный вӱд дене ӱяҥденыт. Чыла обрабатыватлымашым теплицысе условийыште эртареныт (25 ± 2°C, 75 ± 1% относительный вӱдыжгылык, да 8 ч волгыдо/16 ч пычкемыш фотопериод). Чыла лончым кок арнялан ик гана вӱдыжтеныт да тылзе еда 3–4 г/л концентрацийыште балансированный НПК ӱяҥдыш дене (20-20-20, 3,6% кӱртньӧ да ТЭ микроэлемент дене; Zain Seeds, Egypt) лышташ дене ӱяҥдыш дене обрабатыватленыт, ойыртемалтше сортлан темлыме да ыштен лукшо инструкций почеш. Вес семын каласыме огыл гын, тичмаш кумдаҥдыме кушкын шушо лышташ-влакым (ӱлнӧ гыч 2-шо да 3-шо лышташ-влакым) кажне биологий реплике гыч 72 шагат деч вара обрабатыватлыме деч вара (hpt) погеныт, гомогенизироватленыт, чумыреныт да -80 °C температурышто умбакыже лончылымашлан араленыт, тидын шотыштак, но тидын дене гына серлагаш огыл, in situ гистохимический локализаций окислительный стресс индикатор-влак, липоксидный пероксидный да ферментный ферментный огыл антиоксидант-влак да ген экспрессий.
Ош лышташ инфекций интенсивностьым акленыт арняште 21 кече деч вара инокуляция (dpi) 1–9 шкала дене пайдаланен (Ешартыш таблице S2) негызеш Petzoldt да Диксон шкала (1996) вашталтыме Teran et al. (2006). Кӱчыкын, пырче кушкылын лышташыжым да лышташыжым инокуляций точко гыч тӱҥалын шымленыт, межузловой да узел мучко локтылалтмашын прогрессироватлымыжым эскереныт. Вара инокуляций точко гыч эн торасе точко марте лышташ але лышташ мучко локтылалтме верын торалыкшым висыме да локтылалтме верланыме вер негызеш 1–9 баллым пуымо, кушто (1) инокуляций точко воктене нимогай инфекций уке улмым ончыктен да (2–9) локтылалтме кугыт да узел-влак кокласе узел-влак дене прогрессирований эркын-эркын кугеммым ончыктен (S2 таблице). Вара 2-шо формулым кучылтын, ош лышташ дене черланыме кугытшым процентыш савыреныт:
Тылеч посна, чер прогрессирование криволинейный йымалсе кумдыкым (AUDPC) формулым кучылтын шотленыт (Shaner and Finney, 1977), тудо шукерте огыл тыглай пареҥге ош лышташлан келыштарыме лийын (Chauhan et al., 2020) 3-шо уравнений дене пайдаланен:
Кушто Yi = ti жапыште чер нелылык, Yi+1 = вес жапыште чер нелылык ti+1, ti = икымше висымаш жап (кече дене), ti+1 = вес висымаш жап (кече дене), n = жап точко але эскерыме точко-влакын чумыр чотышт. Чыла биологический репликыште 21 кече жапыште арня еда 21 кече жапыште пырче кушкылын кушмо параметрже-влакым, тыгак кушкыл кӱкшытым (см), ик кушкыллан лышташын чотшым да ик кушкыллан лышташын чотшым возен налме.
Кажне биологический репликыште лышташ образец-влакым (ӱлнӧ гыч кокымшо да кумшо тичмаш вияҥше лышташ) обрабатыватлыме деч вара 45-ше кечын (пытартыш обрабатыватлыме деч вара 15 кече гыч) погеныт. Кажне биологический реплике вич лончы гыч шоген (ик лончышто кок кушкыл). Пычкемышыште 4 °C температур годым 80% ацетон дене фотосинтез пигмент-влакым (хлорофилл а, хлорофилл b да каротиноид-влакым) лукташ 500 мг наре ӱштын лукмо тканьым кучылтыныт. шагат гыч образец-влакым центрифугироватлыме да супернатантшым погеныт, хлорофилл а, хлорофилл b да каротиноид содержанийым колориметрически рашемдаш манын, UV-160A спектрофотометр (Shimadzu Corporation, Japan) йӧн дене (Lichtenthaler, 1987) тӱрлӧ толкын кужыт дене висыме йӧн дене (А470, А646 да А663 нм). Пытартышлан, фотосинтез пигмент-влакын содержанийыштым тыгай формулым кучылтын шотленыт, кудым Лихтенталер (1987) сӱретлен.
Обрабатыватлыме деч вара 72 шагат гыч (hpt), лышташ-влакым (ӱлнӧ гыч кокымшо да кумшо тичмаш вияҥше лышташ-влакым) кажне биологический реплике гыч водород перекись (H2O2) да супероксид анион (O2•−) in situ гистохимический локализацийлан погеныт. Кажне биологический реплике вич лончы гыч шоген (ик лончышто кок кушкыл). Кажне биологический репликым дубликатысе (кок технический реплике) лончыленыт, йӧн чынлыкым, ӱшанле да воспроизводимостьым ӱшандарыше. H2O2 да O2•− 0,1% 3,3′-диаминобензидин (DAB; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германий) але нитросиний тетразолий (NBT; Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германий) дене рашемдыме, шот дене, Romero-Puertas et al. (2004) да Адам да молат. (1989) изирак вашталтыш дене. H2O2-н in situ гистохимический локализацийжылан листовкым 10 мМ Tris буферыште (рН 7,8) 0,1% DAB дене вакуумный инфильтраций дене шыҥдареныт, вара 60 минут жапыште пӧлем температур годым волгыдо йымалне инкубироватленыт. Листовко-влакым 0,15% (v/v) ТСА дене 4:1 (v/v) этанол:хлороформ (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Egypt) дене отбеливатьленыт, вара пычкемыш марте волгыдыш луктыныт. Тыгак клапан-влак 10 мМ калий фосфат буфер дене (рН 7,8) вакуумный инфильтрацийым ыштеныт, тушто 0,1 мас./об.% HBT лийын, O2•− in situ гистохимический локализацийлан. Листовкым 20 минут жапыште пӧлем температур годым волгыдышто инкубироватленыт, вара ӱлнӧ ончыктымо семын отбеливатьленыт, вара пычкемыш шем/фиолетовый лапчык-влак лекмешке волгалтареныт. Лӱмын ыштыме кӱрен (H2O2 индикатор семын) але шем-фиолетовый (O2•− индикатор семын) тӱсын пеҥгыдылыкшым ImageJ (http://fiji.sc; 2024 ий 7 мартыште пурен) сӱретым обрабатыватлыме пакетын Фиджи версийжым кучылтын акленыт.
Малондиальдегид (МДА; липид перекисьын маркерже семын) Ду ден Брамлаге (1992) йӧн дене изирак вашталтыш дене рашемдыме. Кажне биологический реплике гыч лышташ-влакым (ӱлнӧ гыч кокымшо да кумшо тичмаш вияҥше лышташ) 72 шагат деч вара обрабатыватлыме деч вара погеныт (hpt). Кажне биологический репликыште вич лончо лийын (ик лончышто кок кушкыл). Кажне биологический репликым дубликатысе (кок технический реплике) лончыленыт, йӧн чынлыкым, ӱшанле да воспроизводимостьым ӱшандарыше. Кӱчыкын, 0,5 г мланде лышташ тканьым 20% трихлоруксус кислота (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, USA) дене MDA лукмашлан кучылтыныт, тушто 0,01% бутилированный гидрокситолуол (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) лийын. Вара супернатантыште МДА содержанийым колориметрически рашемдыме, 532 да 600 нм поглощенийым висыме дене УФ-160А спектрофотометр дене (Shimadzu Corporation, Японий) да вара nmol g−1 FW семын ончыктымо.
Ферментный огыл да ферментный антиоксидант-влакым аклашлан лышташ-влакым (ӱлнӧ гыч кокымшо да кумшо тичмаш вияҥше лышташ-влакым) кажне биологический реплике гыч 72 шагат деч вара обрабатыватлыме деч вара (hpt) погеныт. Кажне биологический реплике вич лончы гыч шоген (ик лончышто кок кушкыл). Кажне биологический образецым кок пачаш лончыленыт (кок технический образец). Кок лышташым вӱдыжгӧ азот дене ӱштыныт да ферментативный да неферментативный антиоксидант-влакым, чумыр аминокислота-влакым, пролин содержанийым, ген экспрессийым да оксалат количествым рашемдаш тура кучылтыныт.
Чылаже растворимый фенол-влакым Folin-Ciocalteu реагент (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) дене рашемдыме, Kahkonen et al. сӱретлыме йӧн дене изишак вашталтышым пуртымо. (1999). Кӱчыкын, иктаж 0,1 г гомогенизироватлыме лышташ тканьым 20 мл 80% метанол дене пычкемышыште 24 шагат жапыште луктыныт да центрифугироватлыме деч вара ӱмбалым погеныт. 0,1 мл образец экстрактым 0,5 мл Фолин-Чокальтеу реагент дене (10%) вашталтеныт, 30 с жапыште лӱҥгеныт да 5 минутлан пычкемышыште коденыт. Вара кажне пробиркыш 0,5 мл 20% натрий карбонат растворым (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Каир, Египет) ешареныт, сайын лугеныт да пӧлем температур годым пычкемышыште 1 шагат инкубироватленыт. Инкубаций деч вара реакций ӱзгарын поглощенийжым 765 нм дене УФ-160А спектрофотометр дене (Shimadzu Corporation, Японий) висыме. Образец экстрактлаште чумыр растворимый фенол-влакын концентрацийыштым галлий кислота калиброватлыме криволинейный (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) полшымо дене рашемдыме да галлий кислота эквивалент миллиграмм дене ончыктымо, кажне грамм свежа нелытлан (мг GAE g-1 свежа нелыт).
Чыла растворимый флавоноид содержанийым Djeridane et al. йӧн дене рашемдыме. (2006) изирак вашталтыш дене. Кӱчыкын, 0,3 мл ӱлнӧ ончыктымо метанол экстрактым 0,3 мл 5% алюминий хлорид раствор дене (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) вашталтеныт, пеҥгыдын луктыныт да вара 5 минут жапыште пӧлем температур годым инкубироватленыт, вара 0,3 мл 0,3 мл калий калий растворым ешареныт. (Аль-Гомхория фармацевтика да медицине сатум, Каир, Египет), сайын луген да пычкемышыште 30 минут жапыште пӧлем температур годым инкубироватьлен. Инкубаций деч вара реакций ӱзгарын поглощенийжым 430 нм дене УФ-160А спектрофотометр дене (Shimadzu Corporation, Японий) висыме. Образец экстрактыште чумыр растворимый флавоноид-влакын концентрацийыштым рутин калиброватлыме криволинейный (TCI America, Portland, OR, USA) дене рашемдыме, вара рутин эквивалент миллиграмм семын ончыктымо, кажне грамм свежа нелытлан (мг RE g-1 свежа нелытан).
Пареҥге лышташын чумыр эрыкан аминокислота содержанийжым вашталтыме нингидрин реагент (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) дене рашемдыме, тудым Йокояма ден Хирамацу (2003) темлыме да Sun et al. (2006). Кӱчыкын, 0,1 г мланде тканьым рН 5,4 буфер дене луктыныт, а 200 мкл супернатант 200 мкл нингидрин (2%) да 200 мкл пиридин (10%; Spectrum Chemical, Нью-Брансуик, Нью-Джерси, США) дене реакцийыш пурталтыныт, вӱдыштӧ шолшо вӱдыштӧ инкубироватьленыт, вара 30 минутлан йӱштӧ вӱдым висыме 580 нм-ыште УФ-160А спектрофотометр дене (Shimadzu Corporation, Японий). Вес могырым, пролиным Бейтс йӧн дене рашемдыме (Bates et al., 1973). Пролиным 3% сульфосалициловый кислота дене луктыныт (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) да центрифугироватлыме деч вара 0,5 мл супернатантым 1 мл ледниковый уксус кислота дене (Fisher Scientific, Hampton, NH, USA) да нингидрин реагент дене вашталтеныт, 90°C температурышто инкубироватьленыт да 45 градус марте йӱлалтеныт ӱлнӧ ончыктымо семынак спектрофотометр дене 520 нм дене висыме. Лышташ экстрактлаште чумыр эрыкан аминокислота ден пролин глицин ден пролин калиброватлыме криволинейный (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) полшымо дене рашемдыме да мг/г свежа нелыт дене ончыктымо.
Антиоксидант фермент-влакын ферментативный активностьыштым рашемдаш манын, 500 мг наре гомогенизированный тканьым 3 мл 50 мМ Трис буфер дене (рН 7,8) луктыныт, тушто 1 мМ ЭДТА-Na2 (Сигма-Ольдрих, Сент-Луис, МО, США) да 7,5% полипирролидрон (ПВП; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 10,000 × g 20 минут жапыште йӱштӧ йымалне (4 °C) центрифугироватлыме, да супернатант (сырьевой фермент экстракт) поген (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Вара каталаза (CAT) 2 мл 0,1 М натрий фосфат буфер (рН 6,5; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) да 100 мкл 269 мМ H2O2 раствор дене реакцийыш пурталтын, тудын ферментный активностьшым Aebi (1984) йӧн дене рашемдаш манын, slight-Nagar et al. 2023; Осман да молат, 2023). Гуайакол деч шога пероксидаза (POX) ферментативный активностьым Harrach et al. йӧн дене рашемдыме. (2009). (2008) изирак вашталтыш дене (Эль-Нагар да молат, 2023; Осман да молат, 2023) да полифенол оксидазын (ППО) ферментативный активностьшым 2,2 мл 100 мМ натрий фосфат буфер дене (рН 6, 10 мкМ) реакций деч вара рашемдыме, химий вещества-влакын 2,00 мкл (1,0 мкТ). Портленд, Орегон, США) да 100 мкл 12 мМ H2O2. Йӧн (Эль-Нагар да молат, 2023; Осман да молат, 2023) гыч изишак вашталтыме. Анализым 0,1 М фосфатный буферыште (рН 6,0) свежа ямдылыме 3 мл катехол раствор дене (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, USA) (0,01 М) реакций деч вара эртареныт. CAT активностьым 240 нм-ыште H2O2-ын шаланымыжым эскерыме дене висыме (A240), POX-ын активностьшым 436 нм-ыште (A436) поглощенийын кугеммыжым эскерыме дене висыме, а PPO-н активностьшым 495 нм-ыште (A495) кажне 30 минутлан поглощенийын вашталтышыжым возен налме дене висыме, UV-фотометрым кучылтын (Симадзу, Японий).
Реальный жапыште RT-PCR кум антиоксидант дене кылдалтше ген-влакын транскрипт кӱкшытыштым пален налаш кучылталтше, нунын коклаште пероксисомный каталаза (PvCAT1; GenBank Accession No. KF033307.1), супероксиддисмутаза (PvSOD; GenBank Accession No. XM_0686395), глютитаза (GenBank Accession No. XM_0686395), да глютитаза (GenBank Accession No. KY195009.1 No-ан ушнымаш), пырче лышташыште (ӱлнӧ гыч кокымшо да кумшо тичмаш вияҥше лышташ) пытартыш обрабатыватлыме деч вара 72 шагат гыч. Кӱчыкын, РНК-м Simply P Total RNA Extraction Kit (Cat. No. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, China) дене ойырен налме, производительын протоколжо почеш. Вара, кДНК-м TOP scriptTM кДНК-синтез комплект дене пайдаланен, производительын инструкцийже почеш синтезироватлыме. Ӱлнӧ ончыктымо кум генын праймер радамже ешартыш таблице S3-ште ончыкталтеш. PvActin-3 (GenBank accession number: XM_068616709.1) пӧрт ген семын кучылталтше да относительный ген экспрессий 2-ΔΔCT йӧн дене шотлен лукмо (Livak and Schmittgen, 2001). Биотический стресс годым актинын пеҥгыдылыкше (тыглай пакчасаска ден Colletotrichum lindemuthianum антракноз лышташ коклаште келшыдыме вашкыл) да абиотический стрессыште (засуха, шӧрлык, изи температур) ончыкталтын (Borges et al., 2012).
Тӱҥалтыште ме S. sclerotiorum-ыште оксалоацетат ацетилгидролаза (ОАХ) белок-влакын геном-кумдык in silico анализыштым белок-белок BLAST ӱзгарым кучылтын (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005) эртаренна. Кӱчыкын, ме OAH гыч Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; таксид: 1191702; GenBank ушнымо номер XP_040799428.1; 342 аминокислота) да Penicillium lagena (PlOAH; таксид: 94218; GenBank ушнымо номер; GenBank ушнымо номер) кучылтынна XP_056833920.1; 316 аминокислота) S. sclerotiorum (таксид: 5180) гомологический белокым картыште ончыкташ йодмаш радам семын. BLASTp эн пытартыш жапыште лийше S. sclerotiorum геном данный ваштареш ыштыме GenBank национальный рӱдер биотехнологий информаций (NCBI) сайтыште, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Тылеч посна, S. sclerotiorum (SsOAH) гыч прогнозироватлыме OAH ген да A. fijiensis CBS 313.89 гыч AfOAH-ын эволюций анализше да филогенетический пушеҥгыже да P. lagena гыч PlOAH MEGA11 (Tamura et al., 2021) да JTT-негызеш ыштыме модельыште эн кугу вероятность йӧн дене ыштыме лийыныт молат, 1992). Филогенетический пушеҥгым S. sclerotiorum гыч чыла ончылгоч палемдыме OAH ген-влакын (SsOAH) белок радамыштым шуко гана келыштарыме анализ дене ушеныт да йодмаш радамым Constraint-Based Alignment Tool (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt_cobalt) да (CoBALT) Агарвала, 2007). Тылеч посна, S. sclerotiorum гыч SsOAH-ын эн келшен толшо аминокислота радамже-влак ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw) дене пайдаланен, йодмаш радам дене (AfOAH да PlOAH) (Larkin et al., 2007) келыштарыме лийыныт, да ESP ӱзгар (3.0 версий; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Умбакыже, S. sclerotiorum SsOAH-ын ончылгоч палемдыме функциональный репрезентативный доменже ден аралыме верже-влакым InterPro ӱзгарым кучылтын (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) интерактивно тӱрлӧ ешлан шеледеныт (Blum et al., 2021). Пытартышлан, прогнозироватлыме S. sclerotiorum SsOAH-ын кум мер (3D) структур моделироватлымашыжым Protein Homology/Analogy Recognition Engine (Phyre2 сервер версий 2.0; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cid=index) (Kelley et al? 2015) да SWISS-MODEL серверым кучылтын пеҥгыдемдыме (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Прогнозироватлыме кум мер структур-влакым (PDB формат) UCSF-Chimera пакетым (1.15 версий; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ ) полшымо дене интерактивный йӧн дене ончыктымо (Pettersen et al., 2004).
Sclerotinia sclerotiorum мицелийыште оксалоацетат ацетилгидролазын (SsOAH; GenBank accession number: XM_001590428.1) транскрипционный кӱкшытшӧ рашемдаш количественный реальный жапыште флуоресценция ПЦР кучылталтше. Кӱчыкын, S. sclerotiorum PDB дене колбашке инокуляцийым ыштеныт да лӱҥгалтше инкубаторыш (модель: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) 25 ± 2 °C температурышто 24 шагат жапыште 150 об/мин да эре пычкемышыште (24 шагат) мицелийын кушмашыжым кумылаҥдаш вераҥденыт. Варажым клетке-влакым L-орнитин да фунгицид Rizolex-T дене пытартыш IC50 концентрацийыште (кокла шот дене 40 да 3,2 мг/л) обрабатыватленыт, вара тыгаяк условийыште эше 24 шагат культурым ыштеныт. Инкубаций деч вара культурым 2500 об/мин 5 минут жапыште центрифугироватлыме да ген экспрессий анализлан супернатант (грибковый мицелий) погеныт. Тыгак грибковый мицелий 0, 24, 48, 72, 96 да 120 ч инфекций деч вара инфицироватлыме кушкыл-влак деч погеныт, нуно инфицироватлыме ткань-влакын ӱмбалнышт ош лышташым да ӱй гай мицелийым ыштеныт. РНК-м грибковый мицелий гыч луктыныт, вара ӱлнӧ ончыктымо семын кДНК-м синтезироватленыт. SsOAH-лан праймер радам-влак ешартыш таблице S3-ште ончыкталтыныт. SsActin (GenBank accession number: XM_001589919.1) пӧрт ген семын кучылталтше, да относительный ген экспрессий 2-ΔΔCT йӧн дене шотлен лукмо (Livak and Schmittgen, 2001).
Щавель кислотам пареҥге декстроза бульонышто (ПДБ) да кушкыл образецлаште, кушто Sclerotinia sclerotiorum грибковый патоген уло, Xu ден Zhang (2000) йӧн дене изирак вашталтыш дене рашемдыме. Кӱчыкын, S. sclerotiorum изолят-влакым PDB-ан колбашке инокулироватленыт, вара лӱҥгалтше инкубаторышто (модель I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, USA) 150 об/мин 25 ± 2 °C 3–5 кече жапыште эре пычкемышыште (24 шагат) мицелийын кушмашыжым кумылаҥдаш куштеныт. Инкубаций деч вара грибковый культурым эн ончыч Whatman #1 фильтр кагаз гоч фильтроватленыт, вара 2500 об/мин 5 минут жапыште центрифугироватленыт, кодшо мицелийым кораҥдаш манын. Оксалатым умбакыже количественно рашемдаш манын, супернатант погеныт да 4°C температурышто араленыт. Кушкыл образец-влакым ямдылыме годым 0,1 г наре кушкыл тканьын ужашыжым кум гана дистиллированный вӱд дене луктыныт (кажне гана 2 мл). Вара образец-влакым 2500 об/мин 5 минут жапыште центрифугироватлыме, ӱмбалым Whatman No. 1 фильтр кагаз гоч сухофильтрироватлыме да умбакыже лончылымашлан погеныт.
Щавель кислотан количественный анализлан реакций ӱзгарым тыгай радам дене стекло пробкышто ямдылыме: 0,2 мл образец (але PDB культур фильтрат але щавел кислота стандарт раствор), 0,11 мл бромфенол кок (BPB, 1 мМ; Fisher Chemical, Pittsburgh, USA, 198 мл), Ml. серный кислота (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Каир, Египет) да 0,176 мл 100 мМ калий дихромат (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, USA), а вара растворым 48 мл вӱд дене луштарыме да пеҥгыдын луштарыме. вигак 60 °C вӱд ванныш пыштеныт. минут гыч реакцийым 0,5 мл натрий гидроксид растворым (NaOH; 0,75 М) ешарен чареныт. Реакций ӱзгарын поглощенийжым (А600) 600 нм-ыште УФ-160 спектрофотометр дене (Shimadzu Corporation, Японий) висыме. PDB ден дистиллированный вӱдым культур фильтрат ден кушкыл образец-влакым шотлымо годым контроль семын кучылтыныт. Культур фильтратлаште щавелевый кислотан концентрацийже, PDB средан ик миллилитрлан микрограмм щавелевый кислота семын ончыкталтеш (μg.mL−1), да лышташ экстрактлаште, щавелевый кислотан микрограммже дене ончыкталтеш, кажне грамм свежа нелытлан (μg.g−1 FW), щавелевый кислотан концентрацийжым (The Firmors Firrs Научный химий, Уолтем, Массачусетс, США).
Шымлымаш жапыште чыла экспериментым тӱрыснек рандомизированный дизайн дене (CRD) ыштыме, кажне эмлымашлан шым биологический реплике да кажне биологический репликыште вич лончо (кок кушкыл лончо) вес семын каласыме огыл гын. Биологический реплике-влакым дубликат дене лончыленыт (кок технический реплике). Икгай экспериментын воспроизводимостьшым тергаш технический реплике-влакым кучылтыныт, но шоя реплике-влак деч утлаш манын, статистике анализыште кучылталтын огытыл. Данный-влакым дисперсий анализ (ANOVA) дене статистически лончыленыт, вара Tukey-Kramer честно значимый ойыртем (HSD) тест дене (p ≤ 0,05) лончыленыт. In vitro экспериментлан IC50 ден IC99 значений-влакым пробит модель дене шотленыт да 95% ӱшанле интервал-влакым шотленыт.
Египетысе Эль-Габия губернийыште тӱрлӧ соя пасу гыч чылаже куд изолятым погеныт. КПК средаште чыла изолят-влак кремга гай ош мицелийым ыштеныт, тудо вашке ӱй гай ош тӱсан лийын (рис. 1А), вара склеротий стадийыште бежевый але кӱрен. Склеротий-влак мӧҥгешла тыгыде, шем, сферический але нерегулярный улыт, 5,2 гыч 7,7 мм кужытан да 3,4 гыч 5,3 мм диаметран улыт (рис. 1В). Ныл изолят 25 ± 2 °C температурышто 10–12 кече инкубаций деч вара культур средан чекыштыже склеротийын маргинальный образецшым вияҥден гынат (рис. 1А), нунын коклаште ик тарелкыште склеротийын чотшо ятырлан ойыртемалтын (Р < 0,001), 3-шо изолятыште эн шуко склероцийын чотшо лийын (33 ± 33.000). склеротий кажне тарелкыште; рис. 1С). Тыгак #3 изолят PDB-ште моло изолят деч шукырак щавелевый кислотам ыштен луктын (3,33 ± 0,49 мкг.мл−1; рис. 1D). #3 изолят Sclerotinia sclerotiorum фитопатогенный лышташын тыглай морфологический да микроскопический характеристикыжым ончыктен. Мутлан, КПК-ште #3 изолят колоний-влак писын кушкыныт, кремга гай ош (рис. 1А), обращений бежевый але волгыдо лосось йошкар-кӱрен, да 25 ± 2°C температурышто 6-7 кече кӱлын, 9 см диаметран тарелкын ӱмбалжым тӱрыснек леведын. Ӱлнӧ ончыктымо морфологический да микроскопический характеристикылан эҥертен, #3 изолят Sclerotinia sclerotiorum семын палемдалтын.
1-ше рис. Тыглай пакчасаска гыч S. sclerotiorum изолят-влакын характеристикышт да патогенностьышт. (A) PDA средаште куд S. sclerotiorum изолят мицелий кушмаш, (B) куд S. sclerotiorum изолят склеротий, (C) склеротий чот (тарелкыште), (D) PDB средаште щавелевый кислота секреций (μg.mL−1), да (E) чер нелылык (%) куд S. sclerotiorum изолят коммерческий йол ӱмбалне восприимчивый. сорт Гиза 3 теплицысе условийыште. Значений-влак вич биологический репликын кокла ± SD-жым ончыктат (n = 5). Тӱрлӧ буква-влак эмлыме коклаште статистически значимый ойыртемым ончыктат (p < 0,05). (F–H) Типичный ош плесень симптом-влак мланде ӱмбалне лышташ да кремний-влак, шот дене, 10 кече деч вара инокуляция дене изолят #3 (dpi). (I) S. sclerotiorum #3 изолят кӧргӧ транскрибироватлыме проставка (ITS) регионын эволюций анализшым эн кугу вероятность йӧн дене ыштыме да 20 эҥертыш изолят/штамм дене таҥастареныт, кудым Национальный рӱдер биотехнологий информаций (NCBI) базыште (https://www.ncbi.nlm.gov./) налыныт. Кластеризаций линий-влак ӱмбалне улшо числа-влак регионын леведышыжым (%) ончыктат, а кластеризаций линий-влак йымалне улшо числа-влак филиал кужытшым ончыктат.
Умбакыже, патогенностьым пеҥгыдемдаш манын, куд налме S. sclerotiorum изолят-влакым теплицысе условийыште восприимчивый коммерческий пырче сорт Giza 3 инокулироватлаш кучылтыныт, тидыже Кохын постулатше дене келшен толеш (рис. 1Е). Чыла налме грибковый изолят-влак патогенный лийыныт да шем пареҥгым инфицироватлен кертыт гынат (cv. Giza 3), мланде ӱмбалне чыла ужашыште (рис. 1F), поснак лышташыште (рис. 1G) да лышташыште (рис. 1H) 10 кече гыч прививкым ыштыме деч вара (рис. 1H) тыглай ош лышташ пале-влакым луктыныт гынат, изолят изолят эн агрессивный лийын кок посна эксперимент. Изолят 3 эн кугу чер нелылыкым (%) лийын пырче кушкыл-влак (24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0, да 76,7 ± 3,1 7, 14, да 21 кече деч вара инфекций, шот дене; рис 1F).
Эн инвазивный S. sclerotiorum изолят #3-ым палемдымашым кӧргӧ транскрибироватлыме проставка (ITS) секвенирование негызеш умбакыже пеҥгыдемдыме (рис. 1I). #3 изолят ден 20 эҥертыш изолят/штамм коклаште филогенетический анализ нунын коклаште кугу икгайлыкым (>99%) ончыктен. Палемдыман, S. sclerotiorum изолят #3 (533 п.н.) американ S. sclerotiorum изолят LPM36 дене кугу икгайлыкше уло, тудым курго пырче урлык гыч ойыреныт (GenBank-ыш ушнымо номер MK896659.1; 540 п.н.) да китай S. sclerotiorum изолят YK896659.1 номер (GenBank-лан ушнымо номер OR206374.1; 548 bp), тидыже фиолетовый (Matthiola incana) лышташ лышташым луктеш, чыланат дендрограммын ӱмбалныже посна тӱшкалан шелалтыт (1I рис.). У радамым NCBI базыш пыштеныт да «Sclerotinia sclerotiorum – YN-25 изолят» (GenBank-ыш ушнымо номер PV202792) манын лӱмденыт. Тудым ужаш лиеш, 3-шо изолят эн инвазивный изолят; сандене тиде изолят умбакыже чыла экспериментыште шымлаш ойырен налме.
Диамин L-орнитинын (Sigma-Aldrich, Дармштадт, Германий) тӱрлӧ концентрацийыште (12,5, 25, 50, 75, 100 да 125 мг/л) S. sclerotiorum изолят 3 ваштареш антибактериальный активностьшым in vitro шымленыт. Палемдыман, L-орнитин антибактериальный эффектым ончыктен да S. sclerotiorum гифын радиальный кушмашыжым дозым шот дене эркын-эркын тормозитлен (рис. 2А, В). Эн кугу концентрацийыште тергыме годым (125 мг/л), L-орнитин эн кугу мицелий кушмашым тормозитлыме темпым ончыктен (99,62 ± 0,27%; рис 2В), тудо коммерческий фунгицид Rizolex-T (торможитлыме темп 99,45 ± 0,39%; рис. 2C) дене эквивалентный лийын, тергыме концентрацийыште мг/л рис. тыгаяк пайдалыкым ончыктышо.
Рисункыште 2. In vitro антибактериальный активность L-орнитин ваштареш Sclerotinia sclerotiorum. (А) S. sclerotiorum ваштареш L-орнитинын тӱрлӧ концентрацийжын антибактериальный активностьшым коммерческий фунгицид Rizolex-T (10 мг/л) дене таҥастарымаш. (B, C) L-орнитин (12,5, 25, 50, 75, 100 да 125 мг/л) але Rizolex-T (2, 4, 6, 8 да 10 мг/л) тӱрлӧ концентраций дене эмлыме деч вара S. sclerotiorum мицелийын кушмашыжым тормозитлыме чот (%). Значений-влак вич биологический репликын кокла ± SD-жым ончыктат (n = 5). Тӱрлӧ буква дене эмлыме коклаште статистике ойыртемым ончыктат (p < 0,05). (D, E) Пробит модель регрессий анализ L-орнитин да коммерческий фунгицид Rizolex-T, шот дене. Пробит модель регрессий линий пеҥгыде кок линий семын ончыкталтеш, а ӱшанле интервал (95%) пунктирный ужар линий семын ончыкталтеш.
Тылеч посна, пробит регрессий анализ ыштыме да келшыше график-влакым 1-ше таблицыште да 2D,E рис-влакыште ончыктымо. Кӱчыкын, приемлемый наклонность значенийже (y = 2.92x − 4.67) да кылдалтше значимый статистике (Cox & Snell R2 = 0.3709, Nagelkerke R2 = 0.4998 да p < 0.0001; рис 2D) L-орнитин ваштареш кугемдыме противогрибковый активность ваштареш ончыктеныт, коммерческий дене таҥастарымаште. фунгицид Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 да p < 0,0001) (1-ше табл.).
Таблица 1. Значенийже пел-максимум тормозящий концентраций (IC50) да IC99 (мг/л) L-орнитин да коммерческий фунгицид “Rizolex-T” ваштареш S. sclerotiorum.
Тӱҥ шотышто, L-орнитин (250 мг/л) обрабатыватлыме тыглай пырче кушкыллаште ош лышташын вияҥмыжым да нелылыкшым ятырлан иземден, обрабатыватлыдыме S. sclerotiorum дене черланыше кушкыл дене таҥастарымаште (контроль; 3А рис.). Кӱчыкын, эмлыдыме инфицироватлыме контрольный кушкыл-влакын чер нелылыкышт эркын-эркын кугемын гынат (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61, да 92,33 ± 3,06%), L-орнитин эксперимент жапыште чер нелылыкым (%) ятырлан иземден (8,97 ± 1,15, 1,00 ± 1,000, да 1,000 ± 0,000, да 1,000 ± .000). 26,36 ± 3,07) 7, 14, да 21 кече деч вара эмлыме (dpt), шот дене (рис 3А). Тыгак, кунам S. sclerotiorum дене черланыше пырче кушкыл-влакым 250 мг/л L-орнитин дене эмленыт, чер прогрессирование криволинейный йымалне кумдык (AUDPC) обрабатыватлыдыме контрольышто 1274,33 ± 33,13 гыч 281,03 ± 7,95 марте иземын, тидыже 50 контроль деч шагалрак лийын. мг/л Ризолекс-Т фунгицид (183,61 ± 7,71; рис. 3В). Тыгаяк тенденций кокымшо экспериментыште эскереныт.
Рис. 3. L-орнитиным экзогенный кучылтмо дене теплицысе условийыште Sclerotinia sclerotiorum дене кылдалтше тыглай пырчын ош лышташыже вияҥме эффект. (А) 250 мг/л L-орнитин дене эмлыме деч вара тыглай пареҥге ош лышташын чер прогрессирование криволинейныйже. (B) L-орнитин дене эмлыме деч вара тыглай пареҥге ош лышташын чер прогрессирование криволинейный (AUDPC) йымалне верланыше кумдык. Значений-влак вич биологический репликын кокла ± SD-жым ончыктат (n = 5). Тӱрлӧ буква дене эмлыме коклаште статистически значимый ойыртемым ончыктат (p < 0,05).
250 мг/л L-орнитин дене экзогенный йӧн дене 42 кече гыч кушкылын кӱкшытшӧ (рис. 4А), ик кушкыллан лышташын чотшо (рис. 4В) да ик кушкыллан лышташын чотшо (рис. 4С) эркын-эркын кугемын. Коммерческий фунгицид Rizolex-T (50 мг/л) шымлыме чыла кочкыш параметрлан эн кугу эффектым ыштен гынат, 250 мг/л L-орнитиным экзогенный кучылтмаш обрабатыватлыдыме контроль дене таҥастарымаште кокымшо кугу эффектым пуэн (рис. 4А–С). Вес могырым, L-орнитин дене эмлыме фотосинтез пигмент-влакын хлорофилл а (рис. 4D) да хлорофилл b (рис. 4Е) содержанийыштлан нимогай кугу эффектым пуэн огыл, но изишак кугемден чумыр каротиноид содержанийже (0,56 ± 0,03 мг/г fr wt) отрицательный контроль дене таҥастарымаште (0,44 ± 0,02 mg fr wt) да позитивный да положительный да мг wt. контроль (0,46 ± 0,02 мг/г fr wt; рис. 4F). Тӱҥ шотышто, тиде лектыш ончыкта, L-орнитин обрабатыватлыме пакчасаскалан фитотоксичный огыл да нунын кушмашыштым кумылаҥден кертеш.
Рис. 4. Теплицысе условийыште Sclerotinia sclerotiorum дене черланыше пареҥге лышташын кушмо характеристикыже да фотосинтез пигментше-влаклан экзогенный L-орнитин дене пайдаланыме эффект. (A) кушкыл кӱкшыт (см), (B) ик кушкыллан лышташ-влакын чотышт, (C) ик кушкыллан лышташ-влакын чотышт, (D) хлорофилл a содержанийже (мг г-1 fr wt), (E) хлорофилл b содержанийже (мг g-1 fr wt), (F) чумыр каротиноид содержанийже (мг g-1 fr wt). Значений-влак вич биологический репликын (n = 5) кокла шотшо ± SD улыт. Тӱрлӧ буква-влак эмлыме коклаште статистически значимый ойыртемым ончыктат (p < 0,05).
Реактивный кислород вид-влакын (ROS; перекись водорода [H2O2] семын ончыктымо) да эрыкан радикал-влакын (супероксидный анион [O2•−] семын ончыктымо) in situ гистохимический локализацийышт ончыктен: L-орнитиным (250 мг/л) экзогенный кучылтмаш H2O (250 ± 3000) погынымашым ятырлан иземден. nmol.g−1 FW; рис. 5А) да O2•− (32,69 ± 8,56 нмоль.g−1 FW; рис. 5В) кок обрабатыватлыдыме черланыше кушкыл-влакын погынымашышт дене таҥастарымаште (173,31 ± 12,06 да 149,35 ± 7,94 nmol.1 FW, шот дене обрабатыватлыме кушкыл дене) мг/л коммерческий фунгицид Rizolex-T (170,12 ± 9,50 да 157,00 ± 7,81 нмоль.g−1 fr wt, шот дене) 72 шагат жапыште. hpt йымалне H2O2 ден O2•− кугу кӱкшытан погыненыт (рис. 5А, В). Тыгак ТСА-негызеш малондиальдегид (МДА) анализ ончыктен: S. sclerotiorum дене черланыше пырче кушкыл-влак лышташыштышт МДА-н кугурак кӱкшытшӧ (113,48 ± 10,02 нмоль.г fr wt) погыненыт (рис. 5С). Туге гынат, L-орнитиным экзогенный кучылтмаш липид перекисьым ятырлан иземден, тидым обрабатыватлыме кушкыллаште МДА содержанийын шагалеммыже ончыкта (33,08 ± 4,00 нмоль.г fr wt).
Рис. 5. Экзогенный L-орнитин кучылтмо годым 72 шагат гыч S. sclerotiorum дене черланыше пареҥге лышташыште оксидативный стрессын тӱҥ маркерже да неферментный антиоксидантный аралыме механизм-влаклан влиянийже. (А) Перекись водорода (H2O2; нмоль г−1 FW) 72 hpt годым, (B) супероксид анион (O2•−; nmol g−1 FW) 72 hpt годым, (C) малондиальдегид (MDA; нмоль g−1 FW) 72 hpt годым, (D) чумыр растворимый фенол (GE g−1 FW) 72 hpt годым hpt, (E) чумыр растворимый флавоноид (мг RE g−1 FW) 72 hpt, (F) чумыр эрыкан аминокислота (мг g−1 FW) 72 hpt, да (G) пролин содержанийже (мг g−1 FW) 72 hpt. Значений-влак 5 биологический репликын (n = 5) кокла ± стандарт ойыртемжым (кокла ± SD) ончыктат. Тӱрлӧ буква-влак эмлыме коклаште статистически значимый ойыртемым ончыктат (p < 0,05).