Кызытсе *Кызытсе адрес: Кельн 50931, Германий, Кельн ийгот дене кылдалтше черлаште клетке стресслан вашмутым пуымо шотышто чапле кластер шымлымаш (CECAD).
Митохондриальный чер-влакын нейродегенерацийышт пӧртылташ лийдымелан шотлалтеш, вет нейрон-влакын метаболический пластичностьышт шагал, но митохондриальный дисфункцийын организмыште нейронный метаболизмын клетке автономийжылан эҥгекше начарын палыме. Тыште ме митохондриальный слияний динамикын пудыргымыжлан кӧра прогрессивный OXPHOS ситыдымаш дене Пуркинже нейрон-влакын клетке-влаклан ойыртемалтше протеомыштым пуртена. Ме пален нална, митохондриальный дисфункций протеомика аланыште кугу вашталтышым тарватен, тидыже мучашлан клетке колымо деч ончыч раш метаболический программе-влакын радамлын активацийышкышт конден. Вучыдымын, ме раш индукций пируват карбоксилаза (PCx) да моло анти-старение фермент-влак, ешартышым ыштен, промежуточный ТКА цикл. PCx-ым тормозитлымаш оксидативный стрессым да нейродегенерацийым лушкыдемден, тидыже ончыкта: атеросклероз OXPHOS уке нейронлаште аралыме эффектым пуа. Терминально дегенерироватлыме нейронлаште митохондриальный слиянийым пӧртылтымаш нине метаболический характеристикым тӱрыснек вашталта, тыге клетке колымашым чара. Мемнан лектышна ончыч палыдыме корным палемдат, нуно митохондриальный дисфункцийлан чытымашым пуат да черланымашын пытартыш стадийыштыже нейродегенерацийым вашталташ лиеш манын ончыктат.
Нейрон энергийын метаболизмжым кучымаште митохондрийын рӱдӧ рольжым айдеме митохондриальный чер дене кылдалтше кумда неврологический симптом-влак палемдат. Тиде чер-влак кокла гыч шукышт ген мутация дене кылдалтыныт, нуно митохондриальный ген экспрессийым регулироватлат (1, 2) але митохондриальный динамике дене кылдалтше ген-влакын пытарымышт дене кылдалтыныт, нуно митохондриальный ДНК-н (мтДНК) пеҥгыдылыкшылан косвенно эҥгекым ыштат (3, 4). Янлык модель дене паша ончыктен: йырым-йырысе тканьлаште митохондриальный дисфункцийлан вашешташ консервативный метаболический корно-влак (5-7) тарванен кертыт, тидыже нине сложный чер-влакын патогенезыштым келгын умылаш кӱлешан информацийым пуа. Тидын деч моло, мемнан умылымашна, ойыртемалтше клетке тип-влакын метаболический вашталтышыштым, кудышт мыйын митохондриальный аденозинтрифосфат (АТФ) ыштен лукмашын чумыр локтылалтмыж дене кылдалтын, тӱҥлан шотлалтеш (8), эмлыме цель-влакым палемдаш кӱлмӧ нерген палемдат, кудым чер деч аралаш але профилактике кучылташ лиеш. Нейродегенераций деч аралаш (9). Информаций ситыдымаш — тиде нерв клетке-влакын йырым-йырысе ткань-влакын клетке типышт дене таҥастарымаште пеш шерге метаболический лывыргылыкышт кумдан шотлалтеш (10). Тиде клетке-влак нейрон-влаклан метаболит-влакым пуымо шотышто рӱдӧ рольым модыт, синаптик передачым кумылаҥдаш да сусыргымаш да чер условийлан вашешташ манын, мыйын тканьын неле условийжылан клетке метаболизмым келыштарен кертмаш глиальный клетке-влак дене гына чак кылдалтын (11-14). Тылеч посна, мыйын тканьын шкешотан клетке гетерогенностьшо ойыртемалтше нейрон подгруппылаште лийше метаболический вашталтышым шымлаш кугу чаракым ышта. Тугак, нейронлаште митохондриальный дисфункцийын раш клетке да метаболический лектышыже нерген шагал палыме.
Митохондриальный дисфункцийын метаболический лектышыжым умылаш манын, ме митохондриальный тӱжвал мембране слиянийын (Mfn2) пытарымыж дене кылдалтше нейродегенерацийын тӱрлӧ этапыштыже улшо Пуркинье нейрон-влакым (ПН) ойырен налынна. Айдеме организмыште Mfn2 мутация-влак наследственный мотор сенсорный невропатийын формыжо дене кылдалтыныт гынат, тудым Шарко-Мари-Тут 2А тип семын палат (15), чыве-влакын Mfn2-н условный пытарымышт — окисление фосфорилирование (OXPHOS) дисфункций йӧн дене сайын палыме индукций. Тӱрлӧ нейронный подтип-влак (16-19) да лекше нейродегенеративный фенотип прогрессивный неврологический симптом дене пырля лийыт, мутлан, тарванылме локтылалтмаш (18, 19) але мозжечковый атаксия (16). Этикетке деч посна количественный (LFQ) протеомик, метаболомик, визуализаций да вирусологический йӧн-влакын комбинацийыштым кучылтын, ме ончыктена, прогрессивный нейродегенераций пируват карбоксилаза (ПКх) да моло фактор-влакым виян тарвата, нуно ПН-влакын артериосклерозыштышт участвоватлат in vivo Фермент-влакын экспрессийышт. Тиде мумо кӱлешлыкшым тергаш манын, ме лӱмынак Mfn2-дефицитный ПН-лаште PCx экспрессийым волтенна, да пален нална: тиде операций оксидативный стрессым луштарен да нейродегенерацийым писынрак ыштен, тыге азооспермий клетке колымашым пуа Метаболический адаптацийым пуа. MFN2-н неле экспрессийже пытартыш дегенераций PN-ым неле OXPHOS ситыдымаш дене, митохондриальный ДНК-н массовый кучылтмашыж дене да, очыни, митохондриальный сетьын пудыргымыж дене, тӱрыснек утарен кертеш, тидыже умбакыже палемда, тиде формо нейродегенераций клетке колымаш деч ончыч черланымашын ончыл стадийыштыже эшеат тӧрланен кертеш.
Mfn2 нокаут ПН-лаште митохондрий-влакым ончыкташ манын, ме чыве штаммым кучылтынна, тудо Cre-зависимый митохондрий-влаклан кӱшыл флуоресцентный белок (YFP) (mtYFP) (20) Cre экспрессийым цельыш шуаш йӧным пуа да in vivo митохондрий морфологийым тергенна. Ме пален нална, мом пытарыме Mfn2 ген PNs лийже манын, эркын-эркын шеледымаш митохондриальный сеть (рис S1A), да эн ондак вашталтышым муын 3 арня ийготан. Вашталтышлан, PN клетке лончын кугу дегенерацийже, кузе тидым Калбиндин иммуноокрашивание йомдарымаш ончыкта, 12 арня марте тӱҥалын огыл (1-ше рис, А да В). Митохондрийын морфологийыштыже эн ончычсо вашталтыш ден нейрон колымашын ужмо тӱҥалтыш коклаште жап келшыдымаш мемнам клетке колымаш деч ончыч митохондрийын дисфункцийже дене кылдалтше метаболический вашталтышым шымлаш таратен. Ме YFP ​​(YFP+)-экспрессирующий PN (рис. 1С) да контрольный чыве-влакым (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre) ойырен налаш флуоресценция дене активироватлыме клетке сортироватлымаш (FACS) негызеш стратегийым ыштенна, умбакыже CTRL (рис. S1BR). YFP сигналын относительный интенсивностьшо негызеш шлюз стратегийым оптимизацийым ыштымаш PN-влакын YFP+ капыштым (YFPhigh) PN-влак деч огыл (YFPneg) (рис. S1B) але предполагаемый флуоресцентный аксон/дендритный фрагмент-влак деч (YFPlow; рис. S1D, шолаште) эрыкташ йӧным пуа, тидым конфокальный микроскоп дене пеҥгыдемдыме (рис. S1D, пурлаште). Классифицироватлыме калыкын личностьшым тергаш манын, ме LFQ протеомикым, вара тӱҥ компонент анализым эртаренна, да YFPhigh ден YFPneg клетке-влак коклаште раш ойыртем улмым пален нална (рис. S1C). YFPhigh клетке-влак палыме PNs маркер-влакын (т.е. Calb1, Pcp2, Grid2 да Itpr3) нетто пойдаралтмыштым ончыктеныт (21, 22), но нейронлаште але вес клетке типлаште тыглай экспрессироватлыме белок-влакын пойдарымашышт уке (рис. 1D) ). Посна экспериментлаште погымо классифицироватлыме YFPhigh клеткылаште образец-влак коклаште таҥастарымаш корреляций коэффициентым> 0,9 ончыктен, тидыже биологический реплике-влак коклаште сай воспроизводимостьым ончыкта (рис. S1E). Иктешлен каласаш гын, тиде данный-влак мемнан планым пеҥгыдемденыт, тыгыде да ойыртемалтше изолироватлымаш ыштен кертме ПН. Вет L7-cre драйвер системым кучылтмо индукций мозаика рекомбинация икымше арняште пуымо деч вара (23), ме чыве-влакым CTRL да условный (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) Нейрон-влакым погаш тӱҥалынна. Рекомбинаций пытымеке, тудым 4 арняште Mfn2cKO маныт. Мучашлан ме 8 арня ийготым ойырен налынна, кунам PN лончо раш митохондриальный фрагментаций гынат, тичмаш лийын (рис. 1В да рис. S1A). Чылаже ме 3013 белокым шотлен луктынна, нунын кокла гыч 22% наре MitoCarta 2.0 аннотаций негызеш лийыныт, нуно митохондриальный протеомым митохондрий семын негызленыт (рис. 1Е) (рис. 1Е) (24). 8-ше арняште эртарыме дифференциальный ген экспрессий анализ ончыктен: чыла белок гыч 10,5% гына кугу вашталтышым ыштен (рис. 1F да рис. S1F), нунын кокла гыч 195 белок йымалне да 120 белок ӱлыкӧ регулироватлалтеш (рис. 1F). Палемдыман, тиде данный-влак наборын «инноваций корно анализше» ончыкта: дифференциально экспрессироватлыме ген-влак тӱҥ шотышто ойыртемалтше метаболический корно-влакын ограничительный наборышкышт пурат (рис. 1G). Оҥай, OXPHOS да кальций сигнализаций дене кылдалтше корно-влакын низкорегулироватлымашышт синтез-дефицитный ПН-лаште митохондриальный дисфункцийым индукцийым пеҥгыдемда гынат, моло категорий-влак, тӱҥ шотышто аминокислота метаболизмым ушештарыше, ятырлан ӱлыкӧ нӧлталтыт, тидыже митохондриальный ПН-лаште лийше метаболизм дене келшен толеш. дисфункций.
(А) CTRL да Mfn2cKO чыве-влакын мозжечковый ужашыштын репрезентативный конфокальный фотографийышт, кушто ПН-влакын прогрессивный йоммыштым ончыктат (калбиндин, шем); ядро-влакым DAPI дене вашталтеныт. (B) Количественный (A) (ик могырым дисперсий анализ, ***P<0.001; n = 4 гыч 6 марте кум чыве гыч йыргешке). (C) Экспериментальный паша радам. (D) Пуркинье (ӱлнӧ) да моло клетке типлан (коклаште) ойыртемалтше маркер-влакын шокшо картыште шеледымашышт. (Е) Венн диаграмме, классифицироватлыме ПН-ыште палемдыме митохондриальный белок-влакын чотыштым ончыкта. (F) 8 арняште Mfn2cKO нейронлаште дифференциально экспрессироватлыме белок-влакын вулкан графикышт (значимость 1,3 значений). (G) Творческий корным лончылымаш Mfn2cKO PN-ыште 8 арнялан шотлымо вич эн кӱлешан ӱлыкӧ (ужар) да ӱлыкӧ (кӱшыл) корным ончыкта. Кажне палемдыме белокын кокла экспрессий кӱкшытшӧ ончыкталтеш. Серый шокшо картыште: тӧрлымӧ P значений. нс, кӱлешан огыл.
Протеомика данный-влак ончыктеныт: I, III да IV комплекс-влакын белок экспрессийышт эркын-эркын шагалемын. I, III да IV комплекслаште чыланат кӱлешан мтДНК-кодироватлыме субединице-влак лийыныт, а II комплекс, тудо ядерный кодироватлыме гына лийын, тӱҥ шотышто нимогай эҥгек лийын огыл (2А рис. да S2А рис.). . Протеомика лектыш дене келшышын, иммуногистохимий мозжечковый ткань ужаш-влак ончыктеныт, мом MTCO1 (митохондриальный цитохром С оксидаза субъединица 1) субъединица кӱкшытыштӧ комплекс IV ПН эркын-эркын иземеш (рис 2В). мтДНК-кодироватлыме субъединица Mtatp8 ятырлан шагалемын (рис. S2A), а ядерный кодироватлыме АТФ-синтаза субъединицан стационар кӱкшытшӧ вашталтыде кодын, тидыже мтДНК-н экспрессийже пеҥгыде улмо годым палыме пеҥгыде АТФ-синтаза подсборка F1 комплекс дене келшен толеш. Формирований келшен толеш. Пӧртылташ (7). Сортироватлыме Mfn2cKO ПН-лаште мтДНК кӱкшытым чын жапыште полимеразный шинчыр реакций (qPCR) дене аклымаш мтДНК копий чотын эркын-эркын шагалеммыжым пеҥгыдемден. Контроль группо дене таҥастарымаште, 8 арняште мтДНК кӱкшытын 20% наре гына кодын (2С рис.). Тиде лектыш дене келшышын, ДНК-м пален налашлан Mfn2cKO PN-влакын конфокальный микроскопий дене чиялтыме йӧн кучылталтше, митохондриальный нуклеотид-влакын жап деч шога кучылтмыштым ончыктен (2D рис.). Ме муын, мом гына южо кандидат-влак митохондриальный белок локтылалтмаш да стресс вашмут ӱлыкӧ регулироватлымаш лийын, нунын коклаште Lonp1, Afg3l2 да Clpx, да OXPHOS комплекс погынымаш фактор-влак. Апоптозышто участвоватлыше белок-влакын кӱкшытыштӧ нимогай кугу вашталтышым палемдыме огыл (рис. S2B). Тыгак ме пален нална: кальцийым шупшыктымаште участвоватлыше митохондрий ден эндоплазменный ретикулум канал-влакын изирак вашталтышышт гына уло (рис. S2C). Тылеч посна, аутофагий дене кылдалтше белок-влакым аклымаш нимогай кугу вашталтышым муын огыл, тидыже иммуногистохимий да электрон микроскопий дене in vivo эскерыме аутофагосом-влакын ужмо индукцийышт дене келшен толеш (рис. S3). Туге гынат, PN-влакын прогрессивный OXPHOS дисфункцийышт раш ультраструктурный митохондриальный вашталтыш дене пырля кая. Митохондриальный кластер-влакым 5 да 8 арня ийготан Mfn2cKO PN-влакын клетке капыштышт да дендрит пушеҥгыштышт ужаш лиеш, а кӧргӧ мембран структурышт кугу вашталтышым эртен (рис. S4, А да В). Тиде ультраструктурный вашталтыш да мтДНК-н ятырлан шагалеммыж дене келшышын, тетраметилродамин метил эфир (ТМРМ) дене пӱсӧ церебральный лаштык-влакым лончылымаш ончыктен: Mfn2cKO ПН-лаште митохондриальный мембранный потенциал ятырлан шагалемын (рис. S4C).
(А) OXPHOS комплексын экспрессий кӱкшытшӧ жапым лончылымаш. арняште P<0,05 дене белок-влакым гына шотыш налза (кок могырым ANOVA). Точечный линий: CTRL дене таҥастарымаште тӧрлатымаш уке. (B) Шолаште: анти-MTCO1 антитела дене палемдыме мозжечковый ужашын примерыже (шкала, 20 мкм). Пуркинье клетке-влакын налме кумдыкышт кӱшыл тӱс дене леведалтын. Пурлаште: MTCO1 кӱкшытым шотлымо (дисперсийын ик могырым лончылымаш; n = 7 гыч 20 марте кум чыве гыч лончылымо клетке). (C) qPCR анализ mtDNA копий номер сортироватлыме PN (ик могырым дисперсий анализ; n = 3 гыч 7 чыве). (D) Шолаште: Анти-ДНК антитела дене палемдыме мозжечковый лаштыкын примерыже (шкала, 20 мкм). Пуркинье клетке-влакын налме кумдыкышт кӱшыл тӱс дене леведалтын. Пурлаште: мтДНК-н локтылалтмыжым шотлымо (дисперсийын ик могырым анализше; кум чыве гыч n = 5 гыч 9 марте клетке). (Е) Пӱтынь клетке патч-кламп записиште mitoYFP + Пуркинже клетке-влакым (стрелка) ончыктышо пӱсӧ мозжечковый ужашын примерыже. (F) IV криволинейный количественный. (G) CTRL да Mfn2cKO Пуркинье клеткылаште деполяризаций токым пуртымо нерген репрезентативный записи. Ӱлыл пале: АП-ым тарватыше икымше импульс. Тӱҥ пале: эн кугу АП чӱчкыдылык. (H) Постсинаптический спонтанный пуртымашым (sPSPs) шотлымо. Репрезентативный записи след да тудын масштабировать коэффициентше (I) ончыкталтеш. Ик могырым дисперсий анализ кум чыве гыч n = 5 гыч 20 марте клеткым лончылен. Данный-влак кокла шот дене ончыкталтыт±SEM; *Р<0,05; **Р<0,01; ***Р<0,001. (J) Перфорированный патч-зажим режим дене возымо спонтанный АП-ын представительный пале-влакше. Ӱлыл пале: Эн кугу АП чӱчкыдылык. Тӱҥалтыш пале: ик АП-ын масштабироватлымашыже. (K) (J) почеш кокла да эн кугу АП чӱчкыдылыкым шотлаш. Манн-Уитни тест; n = 5 клеткым куд чыве гыч лончыленыт. Данный-влак кокла шот дене ончыкталтыт±SEM; кӱлешан огыл.
арня ийготан Mfn2cKO PN-ыште OXPHOS-ын раш локтылалтмыжым пален налме, тидыже нейрон-влакын физиологий функцийышт чот локтылалтмым ончыкта. Сандене ме 4-5 арняште да 7-8 арняште OXPHOS-дефицитный нейрон-влакын пассив электричестве характеристикыштым acute cerebellar лаштыклаште пӱтынь клетке патч-кламп записи-влакым ыштен лончылена (2Е рис.). Вучыдымын, кокла шот дене каныш мембранный потенциал да пуртымо торешланымаш Mfn2cKO нейрон-влак контроль дене икгай лийыныт, гынат, клетке-влак коклаште изирак ойыртем лийын (1-ше табл.). Тыгак 4 гыч 5 арня марте ийготышто ток-напряжений кылыште (IV криволинейный) нимогай кугу вашталтыш лийын огыл (2F рис.). Туге гынат, 7 гыч 8 арня марте Mfn2cKO нейрон-влак IV режим деч (гиперполяризаций ошкыл) илен лектын огытыл, тидыже тиде пытартыш этапыште гиперполяризаций потенциаллан раш чулымлык улмым ончыкта. Вашталтышлан, Mfn2cKO нейронлаште, деполяризующий ток-влак, кудышт повторяющийся действий потенциал (АП) разрядым луктыт, сайын чытат, тидыже нунын чумыр разряд образецышт 8 арня ийготан контрольный нейрон-влак деч ойыртемалтше огыл улмым ончыкта (1-ше табл. да 2G рис.). Тыгак спонтанный постсинаптический токын (sPSCs) чӱчкыдылыкше да амплитудаже контроль группо дене таҥастараш лиеш, да событий-влакын чӱчкыдылыкышт 4 арня гыч 5 арня марте 7 арня гыч 8 арня марте тыгаяк кугеммаш дене кугемын (2-шо рис., H да I). ПН-влакын синаптике кушмо жапышт (25). Тыгаяк лектышым перфорированный ПН-влак патч деч вара налыныт. Тиде конфигураций клетке АТФ ситыдымашым компенсацийым ышташ чаракым ышта, кузе тыге лийын кертеш пӱтынь клетке патч-кламп записи. В частности, каныш мембране потенциал да спонтанный лӱйкалыме чӱчкыдылык Mfn2cKO нейрон-влак огыт локтылалт (рис 2, J да K). Иктешлен каласаш гын, тиде лектыш ончыкта, раш OXPHOS дисфункциян ПН-влак кӱкшӧ частотан разряд образец дене сайын кучедалаш кертыт, тидыже ончыкта, компенсаций механизм уло, тудо нунылан тыглай электрофизиологический вашмутым кучаш йӧным пуа.
Данный-влак кокла шот ± SEM семын ончыкталтыт (дисперсийын ик могырым анализше, Холм-Сидакын шуко таҥастарымаш тестше; *P<0.05). Единице номер скобко дене ончыкталтеш.
Ме шымлаш тӱҥалынна, протеомика данный наборышто кеч-могай категорийыште (рис. 1Г) неле OXPHOS ситыдымашлан тореш лийын кертше корно-влак улыт мо, тыге умылтарена, молан локтылалтше ПН тыглай электрофизиологийым кучен кертеш (рис. 2, Е гыч К марте). . Протеомик анализ ончыктен, молан манаш гын, фермент-влак катаболизмыште участвоватлыше разветвленный шинчыр аминокислота (BCAA) ятырлан ӱлыкӧ регулироватлымаш (рис 3А да рис S5A), да пытартыш продукт ацетил-КоА (КоА) але сукцинил КоА ешартышым ыштен кертеш трикарбоксилат-влак артериосклероз кислота (TCA) цикл. Ме пален нална, мом содержанийже BCAA трансаминаза 1 (BCAT1) да BCAT2 коктынат кугемын. Нуно α-кетоглутарат гыч глутамат генерироватлыме дене BCAA катаболизмын икымше ошкылжым катализироватлат (26). Чыла субъединице, кудышт ветвистый шинчыр кето кислота дегидрогеназа (BCKD) комплексым ыштат, ӱлыкӧ нӧлталтыт (комплекс лекше BCAA углерод скелетын умбакыже да пӧртылташ лийдыме декарбоксилироватлымашыжым катализироватла) (рис. 3А да рис. S5A). Туге гынат, сортироватлыме ПН-ыште BCAA-ште шкеже раш вашталтыш лийын огыл, тидыже тыгай кӱлешан аминокислота-влакым клетке-влакын налмышт кугемме дене але ТСА циклым ешарен, вес источник-влакым (глюкоза але шӧр кислота) кучылтмо дене кылдалтын кертеш (рис. S5B). OXPHOS деч посна PN-влак тыгак 8 арня ийготан глутамин разложение да трансаминирование активность кугеммашым ончыктеныт, тидым митохондриальный фермент-влакын глутаминаза (GLS) да глутамин пируват трансаминаза 2 (GPT2) ӱлыкӧ нӧлталтмышт дене ончыкташ лиеш (рис. 3, А да С). Палемдыман, GLS-ын ӱлыкӧ нӧлталтмыже сплайсированный изоформ глутаминаза С (GLS-GAC) дене гына чак кылдалтын (Mfn2cKO/CTRL-ын вашталтышыже 4,5 пачаш наре, P = 0,05), да тудын рак тканьлаште ойыртемалтше ӱлыкӧ нӧлталтмыже митохондриальный биоэнергийым поддержатлен кертеш. (27).
(А) Шокшо картыште 8 арняште палемдыме корнышто белок кӱкшытын пачаш вашталтышыже ончыкталтеш. (B) Анти-PCx антитела дене палемдыме мозжечковый лаштыкын примерыже (шкала, 20 мкм). Кӱшыл окна Пуркинже клетке капым ончыкта. (C) Жап курс белок экспрессий анализ атеросклероз кӱлешан кандидат семын палемдыме (шуко t-тест, *FDR <5%; n = 3-5 чыве). (D) Ӱлнӧ: [1-13C]пируват трассировщикыште улшо палемдыме углеродыш пуртымо тӱрлӧ йӧн-влакым ончыктышо схема (т.е. PDH але трансартериальный корно гоч). Тӱшка: скрипка диаграммыште ончыктымо процент ик палемдыме углерод (М1) аспартат кислота, лимон кислота да яблочный кислота савырнен деч вара маркироватлымаш acute cerebellar лаштык-влак [1-13C]пируват (парный t-тест; ** P <0.01). (Е) ончыктымо корнын жап историйжым лончылымаш. арняште P<0,05 дене белок-влакым гына шотыш налза. Пунктирный линий: тӧрлымӧ значений уке (дисперсийын кок могырым анализше; * P <0,05; *** P <0,001). Данный-влак кокла шот дене ±SEM семын ончыкталтыт.
Мемнан анализыште, BCAA катаболизм ик эн тӱҥ ӱлыкӧ регулироватлымаш корно лийын. Тиде факт пеҥгыдын ончыкта, молан манаш гын, ТКА циклыш пурышо вентиляций кугыт ОКСФОС деч посна ПН-ыште вашталтен кертеш. Тиде нейронный метаболический перепроводкын тӱҥ формыжым ончыктен кертеш, тудо неле OXPHOS дисфункцийым кучымо годым нейронный физиологийлан да илыше кодмашлан тура влиянийым ыштен кертеш. Тиде гипотез дене келшышын, ме пален нална: тӱҥ антиатеросклеротический фермент PCx ӱлыкӧ нӧлталтеш (Mfn2cKO/CTRL иктаж 1,5 пачаш вашталтеш; рис. 3А), тидыже пируватым оксалоацетатыш савырнымым катализироватла (28), тудо мыйын тканьыште астроцит-влакын экспрессийыштлан шотлалтеш (29, 30). Протеомика лектыш дене келшышын, конфокальный микроскопий ончыктен: PCx экспрессий OXPHOS-дефицитный PN-лаште лӱмынак да ятырлан кугемын, а PCx реактивность тӱҥ шотышто контрольын воктенысе Бергманн глиальный клеткыже-влак дене гына чакнен (рис. 3В). PCx-ын эскерыме ӱлыкӧ нӧлталтмыжым функционально тергаш манын, ме [1-13C]пируват трассировщик дене пӱсӧ мозжечковый лаштык-влакым обрабатыватленна. Кунам пируват пируват дегидрогеназа (ПДГ) дене окисляться, тудын изотоп пале йомын , Но пируват метаболизировать годым сосудистый реакций ТСА цикл промежуточный пуртымо (рис 3D). Мемнан протеомик данныйым пеҥгыдемдаш манын, ме Mfn2cKO лаштык-влакын аспартат кислоташтышт тиде трассировщик гыч шуко маркерым эскеренна, а лимон кислота ден яблочный кислота тыгак кокла тенденций дене ойыртемалтыныт, но значенийже уке (рис. 3D).
Дофамин нейрон-влакын MitoPark чыве-влакын митохондриальный дисфункцийышт дене кылдалтше дофамин нейрон-влакын лӱмынак митохондриальный транскрипций фактор А геным (Tfam) пытарыме дене кылдалтын (рис. S6B), PCx экспрессий тыгак ятырлан кӱшкӧ нӧлталтше лийын (31), тидыже ацетон кислота артериосклерозын лиймыжым ончыкта. ОКСФОС организмыште. Палемдыман, шкешотан фермент-влак (32-34) нейронлаште экспрессироватлалт кертыт, кудышт артериосклероз дене кылдалтын кертыт, OXPHOS-ыште ситыдыме ПН-лаште ятырлан ӱлыкӧ нӧлталтыт, мутлан, пропионил-КоА карбоксилаза (PCC-A), Малонил-КоА пропионил-КоА-коа-коа митохондриальный митохондриальный да малонил-КоА фермент 3 (ME3), тудын тӱҥ рольжо — малат гыч пируватым лукмаш (3-шо рис, А да С) (33, 35). Тылеч посна, ме Pdk3 ферментыште ятырлан кугеммашым муынна, тудо PDH-м фосфорилироватла да тыге инактивироватла (36), а Pdp1 ферментыште, PDH-м активироватлыше але PDH фермент комплексыште шкеже, нимогай вашталтышым палемдыме огыл (рис. 3А). Тыгак, Mern2cKO PN-лаште Ser293-ште PDH комплексын пируват дегидрогеназа E1 компонентшын α1 субъединица α (PDHE1α) субъединицыжын фосфорилироватлымашыже (PDH-ын фермент активностьшым тормозитлыме дене палыме) кугемын (рис. S6C) (рис. S6C). Пируватлан ​​сосудистый йӧн уке.
Пытартышлан, ме муын, мом супер корно серин да глицин биосинтез, кылдалтше митохондриальный фолат (1С) цикл да пролин биосинтез (рис 1G да рис S5C) чыла ятырлан ӱлыкӧ-регулироватлымаш, отчет почеш, активация процесс годым. Йырым-йыр улшо ткань-влак митохондриальный дисфункций дене активироватлалтыт (5-7). Конфокальный анализ, тиде протеомический данныйым пеҥгыдемдыше, ончыктен, мом PN дене OXPHOS уке, 8-арня чыве-влакын мозжечковый лаштык-влак серин гидроксиметилтрансфераза 2 (SHMT2), митохондриальный фолат циклын тӱҥ ферментше, подвергаться. Кӱлешан иммунный вашмут (рис. S5D). CU-глюкоза дене инкубироватлыме пӱсӧ мозжечковый лаштыклаште метаболический трассировка эксперимент-влак умбакыже серин ден пролин биосинтезын ӱлыкӧ нӧлталтмыжым пеҥгыдемденыт, тидыже серин ден пролиныш углерод изоформ-влакын йогынышт кугемын манын ончыкта (рис. S5E). GLS ден GPT2-н кумылаҥдыме реакцийже-влак глутамин гыч глутамат синтезлан да глутамат ден α-кетоглутарат коклаште трансаминацийлан вуйын шогымыштлан кӧра, нунын ӱлыкӧ нӧлталтмышт ончыкта: OXPHOS-дефицитный нейрон-влакын глутаматлан ​​йодмашышт кугемын, тидыже пролинын кугемдыме биосинтезшым арален кодаш виктаралтын кертеш (S5 рис.). Тиде вашталтыш деч ойыртемалтше, PN-специфический Mfn2cKO чыве-влакын мозжечковый астроцит-влакын протеомный анализышт ончыктен: тиде корно-влак (чыла антипероксидазым шотыш налын) экспрессийыште ятырлан вашталтын огытыл, тыге ончыкта Тиде метаболический перенаправлений локтылалтше PN-лан ойырен налме (рис. S6, D гыч G марте).
Иктешлен каласаш гын, нине анализ-влак ПН-лаште ойыртемалтше метаболический корнылам жаплан активироватлыме ятырлан тӱрлӧ образецым ончыктеныт. Нейрон-влакын митохондриальный функцийышт аномальный гынат, ондак атеросклероз да 1С ремоделирование конден кертеш (рис 3Е да рис S5C), да эше прогнозироватлыме вашталтышым I да IV комплекс-влакын экспрессийышт, вашталтышым серин де ново синтез гына улыт Тудо пытартыш этапыште гына раш лийын. OXPHOS дисфункций (рис. 3Е да рис. S5C). Тиде лектыш-влак радамле процессым рашемдат, кушто стресс дене кылдалтше митохондриальный (1С цикл) да цитоплазменный (серин биосинтез) вашмут синергетически ТСА циклыште атеросклероз кугемме дене нейронный метаболизмым вашталташ полшат.
8-арня ийготан OXPHOS-дефицитный ПН-влак кӱкшӧ частотан возбуждение активностьым кучен кертыт да митохондриальный дисфункцийым компенсироватлымашлан кугу метаболический переключение эртен кертыт. Тиде открытий оҥай йӧным луктеш, кеч тиде жапыште тиде клетке-влак нейродегенерацийым шуйкалаш але чараш эмлыме полышым налын кертыт. Варарак. Тиде йӧным ме кок посна интервенций гоч решатленна. Икымше йӧн дене ме Cre-зависимый адено-ассоциированный вирус (AAV) векторым ыштенна, тыге MFN2 in vivo OXPHOS-дефицитный PN-лаште ойырен налме йӧн дене экспрессироватлалтеш (рис. S7A). AAV кодироватлымаш MFN2 да флуоресцентный репортер ген mCherry (Mfn2-AAV) первичный нейрон культурышто in vitro тергеныт, молан манаш гын, MFN2 Cre-зависимый йӧн дене экспрессироватлалтеш да митохондриальный морфологийым утарен, тыге Mfn2cKO нейрон-влак нейромутация деч арален ( рис. S7, D да D). Умбакыже ме in vivo экспериментым эртаренна, 8 арня ийготан Mfn2-AAV-ым Mfn2cKO да контроль чыве-влакын мозжечковый коркашкышт стереотактически пуаш манын, 12 арня ийготан чыве-влакым лончыленна (4А рис.). Эмлыме Mfn2cKO чыве-влак коленыт (рис. 1, А да В) (16). Вирус трансдукций in vivo лектышыш шуын, южо церебеллярный йыргешке-влакыште ПН-ын ойырен налме экспрессийже (рис. S7, G да H). mCherry (Ctrl-AAV) гына экспрессироватлыше контроль AAV-ым инъекций Mfn2cKO янлык-влакын нейродегенераций степеньыштлан кугу эффектым ыштен огыл. Вашталтыш дене таҥастарымаште, Mfn2-AAV дене трансдуцироватлыме Mfn2cKO-влакым лончылымаш PN клетке лончын кугу аралыме эффектыжым ончыктен (4-ше рис, В да С). В частности, нейрон тыгыдылыкше контроль янлык деч ойыртемалтше гай чучеш (4-ше рис, В да С, да S7, Н да I рис). MFN1-ын экспрессийже, но MFN2 огыл, нейрон колымашым арален кодымаште икгай пайдале (рис. 4С да рис. S7, C да F), тидыже ончыкта, молан манаш гын, эктопический MFN1-ын экспрессийже MFN2-н укелыкшым сайын ешарен кертеш. Ик ПН кӱкшытыштӧ умбакыже лончылымаш ончыктен: Mfn2-AAV шукыж годым митохондрийын ультраструктуржым утарен, мтДНК кӱкшытым нормализоватлен да антиангиогенез маркер PCx-ын кугу экспрессийжым вашталтен (4-ше рис, C гыч E марте). Утаралтше Mfn2cKO чыве-влакым каныш состоянийыште шинча дене тергыме годым нунын койыш-шоктышышт да моторлыкышт (S1 гыч S3 марте тарванылмаш) саемыныт. Иктешлен каласаш гын, нине эксперимент-влак ончыктат: OXPHOS-ыште чот ситыдыме PN-лашке MFN2-ым вараш кодымо угыч пуртымаш мтДНК-м кучылтмашым вашталташ да атеросклерозым тарваташ сита, тыге in vivo аксонын локтылалтмыжым да нейрон-влакын колымашыштым чарен шогалта.
(А) ончыктымо метаболический корно тарванылме годым MFN2 кодироватлыше ААВ-ым инъекцийлан экспериментальный графикым ончыктышо схеме. (B) 12 арня ийготан мозжечковый лаштык-влакын репрезентативный конфокальный сӱретышт, 8 арняште Mfn2cKO чыве-влакын трансдуцироватлыме да анти-Кальбиндин антитела дене палемдыме. Пурлаште: аксон волокно-влакын масштабироватлымашышт. Аксон масштабын масштабше 450 да 75 мкм. (C) Шолаште: AAV трансдукций циклыште (AAV+) Пуркинье клетке тыгыдылыкым шотлымо (дисперсийын ик могырым анализше; n = 3 чыве). Пурлаште: мтДНК фокус анализ трансдуцировать ПН арняште 12 (непарный t-тест; n = 6 клетке гыч кум чыве). * Р <0,05; ** Р <0,01. (D) ончыктымо вирус вектор дене трансдуцироватлыме Mfn2cKO мозжечковый ужаш-влакын ПН-влакын репрезентативный передаче электрон микрографийышт. Розовый маска дендрит-влакын налме кумдыкым ончыкта, а кӱшыл точечный квадрат пурлаште пуымо масштабым ончыкта; n ядром ончыкта. Шкаланже, 1 мкм. (Е) 12 арняште трансдуцироватлыме ПН-ыште PCx окрашивание примерым ончыкта. Шкаланже, 20 мкм. ОЭ, ӱлнӧ экспрессий; ФК, вашталтыш.
Пытартышлан, ме OXPHOS дисфункцийым шижше ПН-лаште пероксидаза дене тарватыме клетке-влакын илыме кӱлешлыкыштым шымленна. Ме mCherry кодироватлымаш AAV-shRNA (кӱчык шпильке РНК) лӱмын ыштыме чыве PCx мРНК (AAV-shPCx) генерироватлаш, да вирусым але тудын скрамблированный контрольым (AAV-scr) Mfn2cKO чыве-влакын изирак вуйдорыкышкышт пуртенна. Инъекцийым нылымше арняште ыштеныт (рис. 5А), PCx экспрессий кугемме жапыште (рис. 3С) да PN клетке лончо эше тичмаш лийын (рис. 1А). Палемдыман, PCx-ым волтымо (рис. S8A) PN колымашым ятырлан писынрак ышташ конда, тудо инфицироватлыме йыҥгыр дене гына чак кылдалтын (рис. 5, В да С). PCx ӱлыкӧ нӧлталтме дене кылдалтше метаболический эффект-влакын механизмыштым умылаш манын, ме PCx нокдаун деч вара PN-влакын редокс статусыштым шымленна да AAV-медиировать оптике биодатчик Grx1-roGFP2 ик жапыште экспрессироватлалтеш (рис. S8, B гыч D марте), глутатионым аклаш манын, редокс пептидын относительный вашталтышыжым (3888). Вара ме 7 арня ийготан Mfn2cKO але контрольный литермат-влакын пӱсӧ мыйын лаштыклаштышт кок фотон флуоресценциян ӱмыр мучко сӱретлыме микроскопийым (FLIM) эртаренна, FLIM условийым тергыме деч вара цитоплазме редокс статусышто вашталтышым пален налаш манын (рис. S8, E гыч G марте). Анализ ончыктен, PCx экспрессий деч посна ик Mfn2cKO PN-ын окислений состоянийже ятырлан кугемын, тидыже контроль нейрон деч але Mfn2cKO PN-ын гына скрамблированный shRNA экспрессий деч ойыртемалтеш (рис. 5, D да E). Кунам PCx экспрессий йымалне лийын, процент Mfn2cKO PNs ончыктышо кугу окисленный состоянийыште кум пачаш утла кугемын (рис 5Е), ончыкта, мом PCx ӱлыкӧ регулироватлымаш арален редокс куатым дегенерировать нейрон.
(А) ончыктымо метаболический корно тарванылме годым shPCx-ым кодироватлыше ААВ-ым инъекцийлан экспериментальный графикым ончыктышо схеме. (B) 8 арня ийготан Mfn2cKO чыве-влакын 4 арняште анти-кальциневин антитела дене палемдыме да палемдыме конфокальный фотографийышт. Шкаланже, 450 мкм. (C) AAV-трансдуцированный цикллаште Пуркинье клетке тыгыдылыкым шотлымо (дисперсийын ик могырым анализше; n = 3 гыч 4 чыве марте). Данный-влак кокла шот дене ончыкталтыт±SEM; ***Р<0,001. (D) Представитель FLIM сӱретыште ончыктымо экспериментальный условийыште 7 арня ийготан ПН-ын глутатион редокс датчик Grx1-roGFP2 экспрессироватлыше кокла ӱмыржӧ ончыкталтеш. LUT (look-up table) коэффициент: илыме жап интервал (пикосекунд дене). Шкаланже, 25 мкм. (Е) Гистограмме Grx1-roGFP2 ӱмыр мучко значений-влакын шеледымашыштым ончыкта (D) гыч (n=158 гыч 368 клетке марте кок чыве кажне условийыште). Кажне гистограмме ӱмбалне круговой диаграмме: ятырлан кужурак (ужар, окисленный) але кӱчыкрак (кӱшыл, иземдыме) ӱмыр значений дене клетке-влакын чотыштым ончыкта, нуно CTRL-AAV-scr-ыште кокла ӱмыр значений деч 1 SD деч кугурак улыт. (F) темлыме модель нейронный PCx-ын ӱлыкӧ нӧлталтме аралыме эффектыжым ончыкта.
Чыла тидым шотыш налын, ме тыште пуымо данный-влак ончыктат: MFN2-ын угыч экспрессийже OXPHOS-ын неле ситыдымашыже, мтДНК-н неле пытыме да моткоч аномальный ista-гай морфологий дене ончыл ПН-ым тӱрыснек утарен кертеш, тыге ончыл чер годымат умбакыже прогрессым пуа. Нейродегенераций клетке колымаш деч ончычсо этапын пӧртылташ лийме доказательствыжым пуа. Метаболический лывыргылыкын тиде степеньже эшеат нейрон-влакын атеросклерозым тарватен кертмышт дене палемдалтеш (ТКА циклын перепроводкыжо), тудо OXPHOS деч посна ПН-лаште PCx экспрессийым тормозитла да клетке колымашым кугемда, тыге аралыме рольым модеш (рис. 5F).
Тиде шымлымашыште ме доказательствым пуэнна, молан манаш гын, вашмут PNs OXPHOS дисфункция эркын-эркын конвергенция TCA цикл атеросклероз гоч дифференциальный активация корно активация метаболический программе-влак. Ме протеомный анализым шуко ешартыш йӧн дене пеҥгыдемденна да пален нална: неле митохондриальный дисфункций дене кучедалме годым нейрон-влакын метаболический эластичностьын ончычсо палыдыме формыжо уло. Мемнан ӧрмашлан, пӱтынь перепроводка процесс нейродегенераций дене пырля эркын-эркын да пӧртылташ лийдыме терминал метаболический состоянийым палемдаш ок кӱл, но мемнан данныйна ончыкта, тудо клетке колымаш деч ончычсо этапыштеат обслуживатлыме нейрон лийын кертеш Функциональный компенсаций механизм. Тиде рашемдымаш ончыкта: нейрон-влакын организмыште ятырлан кугу метаболический пластичностьышт уло. Тиде факт ончыкта, молан манаш гын, варарак угыч пуртымо MFN2 тӱҥ метаболический маркер-влакын экспрессийыштым вашталтен кертеш да PN дегенераций деч арален кертеш. Ваштарешыже, тудо атеросклерозым тормозитла да нервым писынрак ышта. транссексуал.
Мемнан шымлымашын ик эн оҥай лектышыже — OXPHOS деч посна PN-влак артериосклерозым лӱмынак тарватыше фермент-влакым нӧлталме дене ТКА циклын метаболизмжым вашталтен кертыт. Метаболический перераспределение — рак клетке-влакын тыглай ойыртемышт, южышт глутаминлан эҥертат, тудо ТСА циклын кокла продуктшым ешарен, восстановительный эквивалент-влакым ыштен луктеш, нуно шӱлыш шинчыр-влакым виктарат да липид да нуклеотид биосинтез прекурсор-влакым ыштен лукмашым арален кодат (39 , 40). Шукерте огыл эртарыме шымлымаш ончыктен: OXPHOS дисфункцийым шижше периферический тканьлаште глутамин/глутамат метаболизмын угыч ушнымыжо тыгак ойыртемалтше ойыртем (5, 41), кушто глутамин TCA циклыш пурымо направлений OXPHOS сусыргымашын нелылыкше дене кылдалтын (41). ). Туге гынат, организмыште нейронный метаболический пластичностьын кеч-могай икгайлыкше да чер контекстыште тудын кӱлешлыкше нерген раш доказательстве уке. Шукерте огыл эртарыме in vitro шымлымашыште тӱҥ кортикальный нейрон-влак нейротрансмиссийлан глутамат пулым мобилизоватлаш ончыктеныт, тыге метаболический стресс условийыште оксидативный метаболизмым да атеросклерозым кумылаҥдат (42). Палемдыман, молан манаш гын, фармакологический торможитлыме йымалне ТСА цикл фермент сукцинатдегидрогеназа, пируват карбоксилирование ӱшанен, синтезым арален кодаш оксалоацетат культурный мозжечковый гранул нейрон (34). Туге гынат, тиде механизм-влакын мыйын тканьлан физиологий кӱлешлыкышт (кушто атеросклероз тӱҥ шотышто астроцит-влак дене кылдалтын манын шонат) эшеат кӱлешан физиологий значениян (43). Тидын годым мемнан данныйна ончыкта, молан манаш гын, PNs локтылалтше OXPHOS организмыште BCAA деградаций да пируват карбоксилирование куснен кертеш, кудыжо кок тӱҥ источник ешартышым ыштен TCA пулан кокласе. Нейрон энергийын метаболизмышкыже BCAA катаболизмын предполагаемый надырже темлалтеш гынат, нейротрансмиссийлан глутамат ден ГАМК-н рольышт деч посна (44), in vivo нине механизм-влаклан эше нимогай доказательстве уке. Сандене, тыге шонаш куштылго: дисфункциональный ПН-влак атеросклерозым кугемдыме дене ассимиляций процесс дене виктаралтше ТСА кокла продукт-влакым кучылтмым автоматически компенсироватлен кертыт. В частности, PCx-ын ӱлыкӧ нӧлталтмыже аспартат кислоталан кугемдыме йодмашым арален кодаш кӱлеш лийын кертеш, тудо митохондриальный дисфункций дене пролиферироватлыше клеткылаште темлалтеш (45). Туге гынат, мемнан метаболомический анализна Mfn2cKO PN-лаште аспартат кислотан стационар кӱкшытыштӧ нимогай кугу вашталтышым ончыктен огыл (рис. S6A), тидыже, очыни, пролиферирующий клетке ден постмитотический нейрон-влак коклаште аспартат кислотан тӱрлӧ метаболический кучылтмашыжым ончыкта. In vivo дисфункциональный нейронлаште PCx-ын ӱлыкӧ нӧлталтме раш механизмыжым рашемдаш кодеш гынат, ме ончыктенна, тиде жап деч ончыч вашмут нейрон-влакын редокс состоянийыштым арален кодымаште кӱлешан рольым модеш, тидым FLIM экспериментлаште мозжечковый лаштык-влак дене ончыктеныт. В частности, PN-влакым PCx-ым ӱлыкӧ нӧлталме деч арален кодымо утларак окисленный состоянийыш конден кертеш да клетке колымашым писынрак ыштен кертеш. BCAA деградацийын активацийже да пируватын карбоксилироватлымашыже митохондриальный дисфункцийын периферический тканьжым палемдаш йӧн огыл (7). Сандене нуно OXPHOS-дефицитный нейрон-влакын приоритетный ойыртемышт улыт, кеч нуно гына огыл гынат, нейродегенерацийлан кӱлешан улыт. .
Мозжечковый чер — нейродегенеративный черын гетерогенный типше, тудо мӧҥгешла атаксий семын палдырна да чӱчкыдынак ПН-лан эҥгекым ышта (46). Тиде нейрон популяций поснак митохондриальный дисфункцийлан лӱдыкшӧ, вет нунын чыве-влакын ойырен налме дегенерацийышт айдеме спиноцеребеллярный атаксийым ончыктышо шуко мотор симптомым угыч ышташ сита (16, 47, 48). Отчет почеш, мутант ген дене трансгенный чыве модель айдеме спиноцеребеллярный атаксий дене кылдалтын да митохондриальный дисфункций дене кылдалтын (49, 50), PNPH-ыште OXPHOS ситыдымашын лектышыжым шымлыме кӱлешлыкым палемдат. Сандене тиде шкешотан нейрон популяцийым ойырен налаш да шымлаш поснак келшен толеш. Туге гынат, PN-влакын давленийлан пеш шижмашышт да пӱтынь мозжечковый клетке популяцийын шагал ужашыжым шотыш налын, шуко омик негызеш шымлымашлан нуным пӱтынь клетке семын ойырен налмаш эшеат неле аспектлан шотлалтеш. Вес клетке тип-влакын (поснак кугыеҥ ткань-влакын) абсолютно локтылалтмыштым шукташ йӧсӧ гынат, ме FACS дене пайдале диссоциаций ошкылым ушенна, тыге йымалне протеомик анализлан ситыше чот илышыш пурташ лийме нейрон-влакым налынна, да улшо данный-влак набор дене таҥастарымаште ятырлан кугу белок леведышым (3000 наре белок) уло (515). Пӱтынь клетке-влакын илышыштым арален кодымо дене, ме тыште пуымо йӧн митохондрийыште метаболический корнылаште вашталтышым тергаш веле огыл, тыгак тудын цитоплазменный коллегыже-влакын вашталтышыштым тергаш йӧным пуа, тидыже клетке типым пойдараш митохондриальный мембранный тег-влакым кучылтмашым ешара. Ме сӱретлыме йӧн Пуркинже клетке-влакым шымлыме дене веле огыл кылдалтын, но черле мыйын метаболический вашталтышым кораҥдаш кеч-могай типлан кучылташ лиеш, тыгак митохондриальный дисфункцийын моло модельжым.
Пытартышлан, ме тиде метаболический вашталтыш процесс годым эмлыме окнам палемдышна, тудо клетке стрессын тӱҥ пале-влакым тӱрыснек вашталтен кертеш да нейрон-влакын локтылалтмыштым чарен кертеш. Сандене, тыште ончыктымо перепроводкын функциональный значенийжым умылен, митохондриальный дисфункций годым нейрон-влакын илышыштым арален кодаш лийме эмлыме йӧн-влак нерген тӱҥ умылымашым пуэн кертеш. Ончыкылык шымлымаш, моло мыйын клетке типлаште энергий метаболизмын вашталтышыжым лончылаш виктаралтше, тиде принципын моло неврологический черлан кучылталтмыжым тичмашын почын пуаш кӱлеш.
MitoPark чыве-влакым ончычсо семынак сӱретленыт (31). C57BL/6N чыве-влак дене loxP фланкирование Mfn2 ген-влак ончыч сӱретленыт (18) да L7-Cre чыве дене ӱчашен (23). Вара лекше кок пачаш гетерозиготный тукымым гомозиготный Mfn2loxP/Mfn2loxP чыве дене ӱчашеныт, тыге Mfn2-лан (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre) Пуркинье-специфический ген нокаут-влакым ыштеныт. Ӱчашымашын подмножествыштыже Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP аллель (stop-mtYFP) ешартыш ӱчашымаш гоч пуртымо (20). Чыла янлык процедурым европысо, национальный да институциональный йӧн дене келшышын эртарыме да Германийысе Северный Рейн-Вестфалий оласе Umwelt ден Verbraucherschutz оласе LandesamtfürNatur компаний пеҥгыдемден. Янлык паша тыгак Европысо лабораторий янлык науко ассоциаций-влакын федерацийыштын йӧнжӧ почеш кая.
Мӱшкыран ӱдырамашын шейный дислокацийжым наркоз деч вара чыве эмбрионым ойырен налыт (Е13). Кортексым 10 мМ Hepes дене ешарен Хэнкс балансированный шӧр растворышто (HBSS) лончыленыт да Dulbecco-н Modified Eagle's Medium-ышкыже пуэныт, тушто папаин (20 Е/мл) да цистеин (1 мкг/мл) лийыныт. Тканьым ДМЭМ-ыште инкубировать) да тудым ферментный вартышым диссоциировать. Ml) 37°C 20 минут жапыште, а вара 10% ушкал шӧр дене ешартышым ыштыме ДМЭМ-ыште механике йӧн дене ӱштыныт. Клетке-влакым 6 см культур тарелкыште 2×106 тыгыдылык дене але 0,5×105 клетке/см2 тыгыдылык дене полилизин дене леведме стакан ӱмбалне ӱденыт, нуным сӱретлыме анализлан ыштеныт. шагат гыч средам Neurobasal сыворотко деч посна среда дене вашталтеныт, тушто 1% B27 ешартыш да 0,5 мМ GlutaMax лийыныт. Вара нейрон-влакым эксперимент мучко 37°C да 5% CO2 температурышто кученыт, арнялан ик гана пукшеныт. In vitro рекомбинацийым тарваташ манын, in vitro кокымшо кечын нейрон-влакым эмлаш 3μl (24-луночный культурный тарелке) але 0,5μl (24-луночный тарелке) тыгай AAV9 вирус векторым кучылтыныт: AAV9.CMV.PI.eGFP. WPRE.bGH (Addgene, каталог номер 105530-AAV9) да AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, каталог номер 105545-AAV9).
Чыве Mfn1 да Mfn2 комплементарный ДНК (Addgene плазмид #23212 да #23213 гыч налме) C-конецыште V5 радам дене палемдалтыныт (GKPIPNPLLGLDST), да T2A радам гоч кадрыште mCherry дене ушненыт. Grx1-roGFP2 — Гейдельбергысе ТП Дик ДФКЗ (Deutsches Krebsforschungszentrum) деч пӧлек. tdTomato кассетым тыглай клонироватлыме йӧн дене вашталтыме дене, кассетым pAAV-CAG-FLEX-tdTomato умшашке (Addgene 28306 справочник номер) субклонироватлыме, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-G FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 да pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 вектор-влак. Тыгаяк стратегий pAAV-CAG-FLEX-mCherry контроль векторым ышташ кучылталтше. AAV-shPCx конструкцийым ышташлан плазмидный AAV вектор (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]) кӱлеш, тудо shRNA-лан таргетингым ыштыше чыве PCx-ым кодироватлыше ДНК-радамым куча (5′CTTTCGCTACCTAGGCTAAGGCTAAGGCTAAGGCTAGACTTAGACTTA 3′) U6 промоторын контрольжо йымалне mCherry CMV промоторын контрольыштыжо кучылталтеш. Полыш ААВ вектор-влакым ыштен лукмашым производительын инструкцийже почеш шуктымо (Cell Biolabs). Кӱчыкын, mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) нумалше кусарыме плазмид дене пайдаланаш, 29AV-MFN2-N2-AV5 клетке-влакын трансфекцийышт, mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) але Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) кодироватлыше ген, тыгак кодироватлыше AAV1 капсид белок да ешартыш белок Упаковочный плазмид плазмид, кальций фосфат йӧн дене пайдаланен. Вирусын сырьевой супернатантшым сухой лум/этанол ваннаште морозильный-оттаивание цикл дене налыныт да фосфат буферный физиологический растворышто (PBS) лизировать клетке-влакым лизироватленыт. ААВ векторым йодиксанол градиент ультрацентрифугирование дене эрыктеныт (24 шагат 32 000 об/мин да 4°C) да Amicon ультра-15 центробежный фильтр дене концентрироватленыт. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 [2,9×1013 геном копий (GC)/мл], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1×1012 GC/мл), AAV1-CAG- FLEX геном титр ончычсо семынак лийын, кузе ончыч сӱретлалтеш (ПЦР-ыште 44 q) -MFN1-V5 (1,9×1013 ГК/мл) да AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9×1012 ГК/мл).
Тӱҥ нейрон-влакым ий йӱштӧ 1x PBS-ыште луктыныт, пеллетироватленыт, вара 0,5% Triton X-100 / 0,5% натрий дезоксихолат/PBS лизис буферыште фосфатаза ден протеаза ингибитор (Roche) дене гомогенизироватленыт. Белокым шотлымо годым бицинхонин кислота анализ (Thermo Fisher Scientific) дене ыштыме. Вара белок-влакым SDS-полиакриламид гель электрофорез дене ойыреныт, вара поливинилиденфторид мембране (GE Healthcare) ӱмбаке блотироватленыт. Неспецифический вер-влакым блокироватлыза да тӱҥ антитела дене (подробнее S1 таблицым ончо) 5% шӧр дене ТБСТ-ште (Трис-буферный физиологический раствор дене Твин), мушмо ошкыл-влак дене да ТБСТ-ште вторичный антитела дене инкубироватлаш. Тӱҥ антитела дене +4°C температурышто йӱдым инкубироватлаш. Мушмо деч вара кокымшо антителым 2 шагат жапыште пӧлем температур годым ӱштыман. Варажым, тыгаяк блотым анти-β-актин антитела дене инкубаций дене, тыгаяк нагрузкым пеҥгыдемдыме. Химилюминесценцийыш савырен да химилюминесценцийым кугемдыме дене пален налмаш (GE Healthcare).
Ончыч стакан ӱмбалне ӱдымӧ нейрон-влакым 4% параформальдегид (ПФА)/ПБС дене палемдыме жапыште пӧлем температур годым 10 минут жапыште пеҥгыдемдыме. Коверслип-влакым ончыч 0,1% Triton X-100/PBS дене 5 минут жапыште пӧлем температур годым шыҥдарат, вара блокироватлыше буферыште [3% ушкал шӧр альбумин (BSA)/PBS]. Кокымшо кечын леведыш-влакым блокироватлыше буфер дене мушмо да келшыше флуорофор дене конъюгированный вторичный антитела дене 2 шагат жапыште пӧлем температур годым инкубироватьлыме; пытартышлан, образец-влакым 4′,6-диамидино-2 -Фенилиндол (DAPI) дене PBS-ыште сайын мушмо, вара микроскоп слайдыште Aqua-Poly/Mount дене пеҥгыдемдыме.
Чыве-влакым (пӧръеҥ ден ӱдырамаш) кетаминым (130 мг/кг) да ксилазиным (10 мг/кг) внутрибрюшинный инъекций дене анестезироватленыт да карпрофен анальгетик дене (5 мг/кг) подкожно пуэныт, стереотактический инструментыш (Копф) вераҥдыме, тудо шокшо дене пойдаралтын. Вуйдорыкым почын пуыза да стоматологический дрель дене ӱпым ӱпшӧ дене келшыше мозжечковый коркан ужашыжым вичкыж ыштат (лямбда гыч: умша 1,8, ӧрдыж 1, IV да V лобуля-влаклан келшен толеш). Ӱлыл шинчаончалтышым пудырташ огыл манын, вуйдорыкышто изи оҥам тыматлын ышташлан шприц дене йыгырмутым кучылтман. Вара вичкыж тарванылше стекло капиллярым микро-пырдыш (-1,3 гыч -1 марте вентральный велыште dura mater) йӱкшен пуртат, да 200 гыч 300 нл марте ААВ-ым микро-инжекторыш (Narishige) кид шприц дене (Narishige) икмыняр гана 20 минут жапыште изи давлений дене пуртат. Настойко деч вара капиллярым эше 10 минутлан вераҥдыза, тыге вирус тӱрыснек шарлен кертеш. Капилляр-влакым лукмо деч вара, яра верым иземдаш да янлыклан паремдаш йӧным ышташ манын, коваштым тыматлын пижыктат. Операций деч вара икмыняр кече янлык-влакым анальгетик дене (каспофен) эмленыт, тиде жапыште нунын кап-кыл состоянийыштым тӱткын эскереныт, вара палемдыме жапыште эвтаназийым эртареныт. Чыла процедурым европысо, национальный да институциональный йӧн дене келшышын эртарыме да Германийысе Северный Рейн-Вестфалий оласе Umwelt ден Verbraucherschutz оласе LandesamtfürNatur компаний пеҥгыдемден.
Янлык-влакым кетамин (100 мг/кг) да ксилазин (10 мг/кг) дене наркоз дене эмленыт, шӱмым ончыч 0,1 М ПФС дене, вара ПФС-ыште 4% ПФА дене перфузийым ыштеныт. Тканьым 4% PFA/PBS дене 4°C температурышто йӱдым шеледеныт да пеҥгыдемденыт. ПБС-ыште пеҥгыдемдыме мыйын гыч сагиттальный ужаш-влакым (50 мкм кӱжгытан) ямдылаш вибраций пычал (Leica Microsystems GmbH, Вена, Австрий) кучылталтше. Вес семын палемдыме огыл гын, эркын йӱлышӧ ужаш-влакым ӱлнӧ ончыктымо семын (13) пӧлем температур годым да ӱпшӧ дене чиялтыме. Кӱчыкын, эн ончыч, налме лаштык-влакым 0,5% Triton X-100/PBS дене 15 минут жапыште пӧлем температур годым пермеабилизироватьленыт; южо эпитоплан (Pcx да Shmt2), 80°C (PH 9) трис-ЭДТА буферыште тиде ошкыл олмеш 25 минут жапыште лаштык-влакым шокшо. Умбакыже ужаш-влакым тӱҥ антитела дене (S1 таблицым ончо) блокироватлыше буферыште (3% BSA/PBS) 4°C температурышто йӱдым ӱпшалтме дене инкубироватьленыт. Вес кечынже секций-влакым блокироватлыше буфер дене мушмо да келшыше флуорофор дене конъюгированный вторичный антитела дене 2 шагат жапыште пӧлем температур годым инкубироватьлыме; пытартышлан, ужаш-влакым PBS-ыште сайын мушмо, DAPI дене ваштареш чиялтыме, вара AquaPolymount дене микроскоп слайд дене пеҥгыдемдыме.
Образецым сӱретлаш лазер сканироватлыме конфокальный микроскопым (TCS SP8-X але TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems) кучылтыныт, тудо ош волгыдо лазер да 405 диод ультрафиолетовый лазер дене пойдаралтын. Флюорофорым тарватен да сигналым гибридный детектор (HyDs) дене поген, LAS-X программе дене радамлыме режимыште Найквист дискретизацийлан келшыше штабелироватьлыме сӱрет-влакым поген: количественный огыл панель-влаклан тудо пеш динамике сигнал-влак (мутлан, соматический клеткыште да дендритыште) mtYFPD hybrid detector-ын чын номерышкыже режим). Фоным иземдаш 0,3 гыч 6 нс марте шлюз кучылталтеш.
Сортироватлыме клетке-влакым чын жапыште сӱретлымаш. Neurobasal-A средаште 1% B27 ешартышым да 0,5 мМ GlutaMax сортироватлыме деч вара, клетке-влакым вигак поли-l-лизин дене леведме стекло слайд-влак ӱмбаке ӱденыт (μ-Slide8 Ну, Ibidi, каталог номер 80826) , а вара тудым 37°C да 5% CO температурышто кученыт да 12 шагат марте клеткылан радамлен. Реальный жапыште сӱретлымашым Leica SP8 лазер сканироватлымаш конфокальный микроскоп дене ыштыме, тудо ош лазер, HyD, 63×[1.4 числан диафрагме (NA)] нефть объектив линзе да шокшо этап дене пойдаралтын.
Чыве дене вашке углекислый газ дене наркозым ыштеныт да вуйжым руэныт, мыйын вуйдорыкшо гыч писын луктыныт да 200 мкм кӱжгытан (13С маркироватлымаш экспериментлан) але 275 мкм кӱжгытан (кок фотон экспериментлан) сагиттальный ужашыш тыгай материал дене теменыт. Вальдорф, Германий) тыгай вещества дене темын: 125 мМ ий йӱштӧ, углерод дене темше (95% O2 да 5% CO2) низко Ca2 + искусственный цереброспинальный жидкость (ACSF) NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буфер, NaCl 2,5 мМ глюза 0,5 мМ CaCl2 да 3,5 мМ MgCl2 (осмотический давлений 310 гыч 330 ммоль марте). Налме мыйын лаштык-влакым ончылгоч инкубаций камерыш кусарыза, тушто кугурак Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буфер, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 10 мМ Ca.Cl да 20 мМ Ca.Cl). MgCl2) среда) рН 7,4 да 310 гыч 320 ммоль марте).
Визуализаций процесс годым лаштык-влакым лӱмын ыштыме визуализаций пӧлемыш кусареныт, да экспериментым 32° гыч 33°C марте температур годым умбакыже ACSF перфузий йымалне эртареныт. Срез-визуализацийлан Leica 25x объектив дене (NA 0,95, вӱд), Ti: Sapphire лазер (Chameleon Vision II, Coherent) дене пойдаралтше мультифотонный лазер сканироватлыше микроскопым (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems) кучылтыныт. FLIM модуль (ПикоХарп300, ПикоКвант).
Grx1-roGFP2-ын ФЛИМ-же. ПН-влакын цитоплазме редокс состоянийыштын вашталтышыштым сагиттальный мыйын лаштыклаште кок фотон FLIM дене висыме, кушто Grx1-roGFP2 биодатчик ПН-влакым виктарен. PN лончышто налме аланыште 50 гыч 80 мкм марте йымалне лаштык ӱмбалым ойырен налыт, тыге илышыш пурташ лийме PN (тиде дендрит-влак мучко бисер структур але нейрон морфологический вашталтыш укелык) да кок пачаш положительный roGFP2 датчик да AAV кодироватлыше shRNA PCx але тудын радамжым контрольышто кучымо (cachee coexpressing mCherry coexpressing) уло. Ик стекан сӱрет-влакым 2x цифровой зум дене погаш [возбуждение толкын кужытшо: 890 нм; 512 нм 512 пиксель]. Палемдымаш: кӧргӧ HyD, флуоресцеин изотиоцианат (FITC) фильтр группо] да 2-3 минут жапыште сӱретым кокла шот дене налмаш кучылталтеш, тыге криволинейный келыштарыме ситыше фотон-влак погеныт (чылаже 1000 фотон). Grx1-roGFP2 зондын чулымлыкшым да FLIM условийым тергымашым roGFP2-ын ӱмыржӧ значенийжым эскерыме дене ыштыме, кунам перфузионный ACSF-ыш экзогенный 10 мМ H2O2 ешареныт (окислением кугемдаш манын, ӱмыржым кугемдаш), а вара 2 мМ дитиотритым ешарен (тидын лектышыже иземме степеньым иземдаш ӱмыр лугыч лиймаш) (рис. S8, D гыч G марте). Налме лектышым лончылаш FLIMfit 5.1.1 программе дене пайдаланен, уло сӱретын ик экспоненциальный лушкыдемме криволинейныйжым висыме IRF (инструмент вашмут функций) дене келыштарен, да χ2 иктаж 1. Ик ПН-ын ӱмыржым шотлашлан нерв кап йыр маскым кид дене сӱретленыт, маскын ӱмыржым кокла шот дене шотленыт.
Митохондриальный потенциал анализ. Пӱсӧ ужашым 100 нМ ТМРМ дене 30 минут жапыште перфузироватлыме АКСФ-ыш тура ешарен инкубаций деч вара, ПН-влакын митохондриальный потенциал вашталтышыштым кок фотон микроскоп дене висыме. ТМРМ-визуализацийым 920 нм зондым тарватыме да сигналым погаш кӧргӧ HyD (тетраметилродамин изотиоцианат: 585/40 нм) кучылтмо дене ыштыме; икгай возбуждение толкын кужыт дене пайдаланен, но тӱрлӧ кӧргӧ HyD (FITC :525/50) кучылтын, mtYFP-ым сӱретлаш. Ик клетке кӱкшытыштӧ митохондриальный потенциалжым аклаш ImageJ-ын Image Calculator плагинжым кучылтман. Кӱчыкын, плагин уравнений: сигнал = мин (mtYFP, TMRM) митохондриальный регионым палемдаш кучылталтеш, тудо TMRM сигналым Purkinje Somali йылмыште ончыкта, келшыше каналын ик стека конфокальный сӱретыштыже. Вара лекше маскаште пиксель кумдыкым шотлат, а вара mtYFP каналын келшыше порог ик стека образыштыже нормализоватлат, митохондриальный потенциалым ончыктышо митохондриальный фракцийым налаш манын.
Сӱретым Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) программе дене ойыреныт. Плитке-влакын сканироватлыме сӱретыштлан ик плитке монтажым LAS-X программе дене пуымо автоматический пидме алгоритм дене ыштат. Сӱретым калиброватлыме деч вара ImageJ ден Adobe Photoshop-ым кучылтса, сӱретым умбакыже обрабатыватлаш да волгыдо ден контрастым икгай келыштараш. Графикым ямдылыме годым Adobe Illustrator-ым кучылтман.
мтДНК фокус анализ. Конфокальный микроскоп дене ДНК ваштареш антитела дене палемдыме мозжечковый ужашлаште мтДНК локтылалтмашын чотшым шотленыт. Кажне цель кумдыкым клетке каплан да кажне клеткын ядрожлан ыштыме, а келшыше кумдыкым Multi Measure плагин (ImageJ программе) полшымо дене шотлымо. Цитоплазме кумдыкым налаш манын, клетке кап кумдык гыч ядро ​​кумдыкым кораҥдыза. Пытартышлан, Analyze Particles плагин (ImageJ программе) пороговый сӱретыште мтДНК-м ончыктышо цитоплазме ДНК-н точко-влакым автоматически шотлаш кучылталтше, да налме лектышым CTRL чыве-влакын PN кокла шот дене нормализоватлыме. Лектышым ик клеткыште кокла шот дене нуклеозид-влакын чотышт семын ончыктат.
Белок экспрессийым лончылымаш. ImageJ-ын Image Calculator плагинжым кучылтын, ик клетке кӱкшытыштӧ PN-ыште белок экспрессийым аклаш. Кӱчыкын каласаш гын, келшыше каналын ик пачаш конфокальный сӱретыштыже, тыгай уравнений гоч: сигнал = мин (mtYFP, антитела), Пуркинаште иктаж-могай антителалан иммунореактивностьым ончыктышо митохондриальный регион палемдалтеш. Вара лекше маскаште пиксель кумдыкым шотлат, а вара mtYFP каналын келшыше пороговый ик стека образыштыже ончыктымо белокын митохондриальный фракцийжым налаш нормализоватлат.
Пуркинье клетке тыгыдылыкым лончылымаш. ImageJ-ын Cell Counter плагинже дене Пуркинье тыгыдылыкым аклаш кучылталтше, шотлымо Пуркинье клетке-влакын чотыштым шотлымо клетке-влакын налме мозжечковый йыҥгыр кужытшо дене шеледымаш дене.
Образецым ямдылымаш да погымо. Контрольный группо гыч мыйын да Mfn2cKO чыве-влак 2% PFA/2,5% глутаральдегид 0,1 М фосфатный буферыште (PB) пеҥгыдемдалтыныт, а вара корональный ужаш-влакым реснит-влакым кучылтын ямдыленыт (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрий) (50 гыч 60 мкм марте кӱжгыт) 1% PB буферыште пеҥгыдемдыме тетраоксид да 1,5% калий ферроцианид пӧлем температур годым 1 шагат жапыште. Секций-влакым дистиллированный вӱд дене кум гана мушмо, вара 20 минут жапыште 1% уранилацетат дене 70% этанол дене чиялтыме. Вара секций-влакым градуированный спирт дене йӱлалтеныт да Durcupan ACM (Araldite casting resin M) эпоксидный смола (Electron Microscopy Sciences, каталог номер 14040) кремний дене леведме стекло слайд коклаште шыҥдареныт, а адакат 60°C температурышто 48 шагат жапыште духовкышто полимеризироватленыт. Мозжечковый корка кумдыкым ойырен налыныт да 50 нм ультратонкий ужаш-влакым Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Вена, Австрий) ӱмбалне ӱштыныт да полистирол плёнко дене леведме 2×1 мм кӱртньӧ шелше тор ӱмбалне погеныт. Секций-влакым 10 минут жапыште 4% уранилацетат раствор дене H2O дене чиялтеныт, H2O дене икмыняр гана мушмо, вара 10 минут жапыште H2O дене Рейнольдс свинец цитрат дене мушмо, вара икмыняр гана H2O дене мушмо. Микрографий-влакым Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) передаче электрон микроскоп дене TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 цифровой фотоаппарат (TVIPS GmbH, Gauting, USA) дене ыштыме. Германий).
ААВ дене черланыше чыве-влаклан мыйын ойырен налме да 1 мм кӱжгытан сагиттальный ужашлан шеледыме, а вуйдорыкшо флуоресцентный микроскоп дене шымлыме, ААВ дене черланыше йыҥгыр (тиде mCherry экспрессирующий) палемдаш манын. Эксперимент-влак гына кучылталтыт, кушто ААВ-ым инъекций дене Пуркинье клетке лончын (т.е. уло лончын) шагал огыл кок радам дене ыштыме мозжечковый йыҥгырыште пеш кугу трансдукций пайдалыкше лектеш. ААВ-трансдуцированный петле йӱдым фиксаций деч вара микродиссекция лийын (4% ПФА да 2,5% глутаральдегид 0,1 М какао буферыште) да умбакыже обрабатыватлалтеш. EPON встраивание, пеҥгыдемдыме тканьым 0,1 М натрий какао буфер дене мушмо (Applichem), да 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) дене 0,1 М натрий какао буферыште (Applichem) 4 шагат инкубировать, вара 2 шагат мушмо. 0,1 М кокамид буфер дене 3 гана угыч ыштыза. Варажым, тканьым йӱлалташ манын, кажне этанол растворым 4°C температурышто 15 минут жапыште инкубацийлан ӱлыкӧ нӧлталтше радам дене этанол кучылталтше. Тканьым пропилен оксидыш кусареныт да 4°C температурышто EPON (Sigma-Aldrich) йӱдым инкубироватленыт. Тканьым 2 шагат жапыште пӧлем температурышто свежа ЭПОН-ыш пыштыза, вара 72 шагатлан ​​62°C температурышто пыштыза. Ультрамикротом (Leica Microsystems, UC6) да алмаз пычал (Diatome, Biel, Switzerland) дене 70 нм ультравичкыж ужаш-влакым пӱчкедыза, 37°C температурышто 15 минут жапыште 1,5% уранилацетат дене чиялтыза, 4 минут жапыште свинец цитрат раствор дене чиялтыза. Электрон микрографий-влакым JEM-2100 Plus передаче электрон микроскоп (JEOL) дене ыштыме, тудо Camera OneView 4K 16-bit (Gatan) да DigitalMicrograph программе (Gatan) дене пойдаралтын. Анализлан электрон микрографийым 5000× але 10000× цифровой зум дене налыныт.
Митохондрийын морфологический анализше. Чыла анализлан посна митохондрий-влакын контурыштым ImageJ программе полшымо дене цифровой сӱретыште кид дене ончыктымо. Тӱрлӧ морфологический параметр-влакым лончылат. Митохондриальный тыгыдылык кажне клеткын чумыр митохондриальный кумдыкшым цитоплазме кумдыклан (цитоплазме кумдык = клетке кумдык-клетке ядро ​​кумдык) × 100 дене шеледыме дене налме процент семын ончыкталтеш. Митохондрийын йыргешкелыкшым [4π∙(кумдык/периметр 2)] формул дене шотлат. Митохондрийын ista морфологийжым лончыленыт да тӱҥ формышт почеш кок категорийлан («трубчатый» да «пузырьковый») шеледеныт.
Аутофагосома/лизосома числа да тыгыдылыкым лончылымаш. ImageJ программе дене пайдаланен, цифровой сӱретыште кажне аутофагосомын/лизосомын контуржым кид дене ойырен налза. Аутофагосома/лизосома кумдык процент семын ончыкталтеш, тудым кажне клеткын чумыр аутофагосома/лизосома структур кумдыкшым цитоплазме кумдыклан (цитоплазме кумдык=клетке кумдык-ядро кумдык)×100 шеледымаш дене шотлат. Аутофагосом/лизосом-влакын тыгыдылыкыштым чумыр чотшым ик клеткыште аутофагосом/лизосом структур-влакын чотыштлан шеледымаш дене шотлат (цитоплазме кумдык шотышто) (цитоплазме кумдык = клетке кумдык-ядерный кумдык).
Пӱсӧ секцийлан да образецым ямдылыме годым маркироватлымаш. Глюкоза маркироватлымашым йодшо эксперимент-влаклан пӱсӧ мыйын лаштык-влакым ончылгоч инкубаций камерыш кусарыме, тушто шыҥдаралтше углерод (95% O2 да 5% CO2), кугу Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буфер, 2,5 мМ NaCl, 2,05 мМ NaCl. d-глюкоза, 1,0 мМ CaCl 2 да 2,0 мМ MgCl 2, рН 7,4 да 310 гыч 320 мОсм марте келыштарыме), кушто глюкоза 13 C 6- Глюкоза алмаштышыже (Eurisotop, каталог номер CLM-1396). Пируват маркироватлымашым йодшо эксперимент-влаклан пӱсӧ мыйын лаштык-влакым кугурак Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буфер, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 10 мМ Ca.Cl да Ad. MgCl2, рН 7,4 да 310 марте 320 мОсм марте келыштараш), да 1 мМ 1-[1-13C]пируват (Eurisotop, каталог номер CLM-1082) ешарен. Секций-влакым 37°C температурышто 90 минут жапыште инкубироватлаш. Эксперимент мучаште ужаш-влакым 75 мМ аммиак карбонат дене вӱдышӧ раствор дене (рН 7,4) писын мушмо, вара 40:40:20 (v:v:v) ацетонитрил (ACN): метанол: вӱд дене гомогенизироватлыме. Секций-влакым 30 минут жапыште лум ӱмбалне инкубаций деч вара, образец-влакым 21 000 г 10 минут жапыште 4°C центрифугироватлыме, а раш супернатант SpeedVac концентраторышто сушитлыме. Лӱмын ыштыме сухофруктовый метаболит пеллет анализ марте -80°C температурышто аралалтеш.
С-палемдыме аминокислотын жидкостной хроматографий-масс-спектрометрий анализше. Жидкостный хроматографий-масс-спектрометрий (ЖХ-МС) анализлан метаболит пеллетым 75 мкл ЖХ-МС сорт вӱдыштӧ (Honeywell) ресуспендироватлыме. 000 г 5 минут жапыште 4°C центрифугироватлыме деч вара 20 мкл рашемдыме супернатант аминокислота флюс анализлан кучылталтше, а моло экстракт вигак анионный анализлан кучылталтше (умбакыже ончо). Аминокислота анализ ончычсо бензоилхлорид дериватизаций протокол дене ыштыме (55, 56). Икымше ошкыллан 20 мкл метаболит экстрактлан 10 мкл 100 мМ натрий карбонат (Сигма-Ольдрих) ешареныт, вара LC сортан ACN-лан 10 мкл 2% бензоилхлорид (Сигма-Ольдрих) ешареныт. Образецым кӱчык жаплан вихревой йӧн дене луктыныт, вара 21 000 г 5 минут жапыште 20°C температурышто центрифугироватленыт. Эрыктен налме ӱмбалым 2 мл автопробирочный флаконыш конус гай стекло вставке дене (200 мкл объем) кусарыза. Образец-влакым Acquity iClass ультракугу лектышан LC системым (Waters) кучылтын лончыленыт, тудо Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) кӱкшӧ разрешениян рашлык масс-спектрометр (Thermo Fisher Scientific) дене ушен. Анализлан 2 мкл производный образецым 100×1,0 мм кӱкшӧ пеҥгыдылыкан кремний Т3 колонкыш (Вӱд) 1,8 мкм ӱзгар-влак дене пуртеныт. Йогын 100 мкл/мин, а буферный системе А буфер (вӱдыштӧ 10 мМ аммоний формиат да 0,15% муравейник кислота) да В буфер (ACN) гыч шога. Градиент тыгай: 0%B 0 минутышто; 0%B. 0 гыч 15% марте B 0 гыч 0,1 минут марте; 15 гыч 17% B 0,1 гыч 0,5 минут марте; В 17 гыч 55% марте 0,5 гыч 14 минут марте; В 55 гыч 70% марте 14 гыч 14,5 минут марте; 14,5 гыч 70 гыч 100% марте B 18 минут жапыште; 100% B 18 гыч 19 минут марте; 100 гыч 0% марте B 19 гыч 19,1 минут марте; 0% B 19,1 гыч 28 минут марте (55, 56). QE-HF масс-спектрометр 50 гыч 750 марте m/z (масса/заряд коэффициент) дене положительный ионизаций режимыште пашам ышта. Кучылтмо разрешения 60 000, а налме коэффициент контроль (AGC) ион цель — 3×106, а эн кугу ион жап — 1000 миллисекунд. Шокшо электроспрей ионизаций (ЭСИ) источник 3,5 кВ напряжений дене пашам ышта, 250°C капилляр температур, 60 АЕ (произвольный единице) оболочка юж йогын да 20 АУ полыш юж йогын. 250°C. S объектив 60 AU марте шындалтын.
Анионный хроматографий-МС анализ 13С палемдыме органике кислота. Кодшо метаболит ӱпшым (55 мкл) Dionex ион хроматографий системым (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific) кучылтын лончыленыт, тудо QE-HF масс-спектрометр дене (Thermo Fisher Scientific) ушен. Кӱчыкын, 5μl метаболит экстракт Dionex IonPac AS11-HC колонкыш пуртымо, тудо ВЭЖХ дене пойдаралтын (2 мм×250 мм, 4мкм кугытан, Thermo Fisher Scientific) пуш-ин ужаш цикл режимыште 1 темдалме коэффициент дене. ) Dionex IonPac AG11-HCguard колонко ( x250 мм, 250 мм 4мкм, Термо Фишер Сайентифик). Колонкын температуржо 30°C марте куча, а автопробник 6°C марте шындалтеш. Элюент генератор гоч калий гидроксид градиент генерироватлаш деионизированный вӱд дене пуымо калий гидроксид картриджым кучылташ. Метаболит-влакым 380 мкл/мин йогын дене ойырен налмаш, тыгай градиент дене пайдаланен: 0 гыч 3 минут марте, 10 мМ КОН; 3 гыч 12 минут марте, 10 гыч 50 мМ KOH; 12 гыч 19 минут марте, 50 гыч 100 мМ KOH; 19 гыч 21 минут марте , 100 мМ КОН; 21 гыч 21,5 минут марте, 100 гыч 10 мМ KOH. Колонкым 10 мМ КОН йымалне 8,5 минут жапыште угыч эквивалентироватленыт.
Элюироватлыме метаболит-влакым колонко деч вара 150 мкл/мин изопропанол ешартыш йогын дене ушеныт, вара отрицательный ионизаций режимыште пашам ыштыше кӱкшӧ разрешениян масс-спектрометр деке виктарат. MS m/z 50 гыч 750 марте 60 000 разрешениян масса диапазоным эскера. AGC 1×106 шындалтын, а эн кугу ион жап 100 мс куча. Шокшо ESI источник 3,5 кВ напряжений дене пашам ыштен. Ион источникын моло параметрже-влак тыгай улыт: капилляр температур 275°C; оболочка газ йогын, 60 АУ; полышкалыше газ йогын, 20 AU 300°C, да S линзе 60 AU марте шындымаш.
13С палемдыме метаболит-влакын данныйыштым лончылымаш. Изотоп-влакын отношенийышт нерген данныйым лончылымашлан TraceFinder программе (4.2 версий, Thermo Fisher Scientific) кучылтман. Кажне соединенийын идентичностьшым ӱшанле эҥертыш соединений дене тергеныт да посна лончыленыт. Изотоп пойдарымашым лончылаш манын, [M + H] + гыч кажне 13C изотопын (Mn) лукмо ион хроматограммыжын (XIC) кумдыкшым лукмо, кушто n — цель соединенийын углерод числаже, аминокислота-влакым лончылаш кучылталтеш але [ MH] + анион-влакым лончылаш кучылталтеш. XIC-ын массовый чынлыкше миллионлан вич ужаш деч шагалрак, а RT-н чынлыкше 0,05 минут. Пойдарымаш анализ кажне палемдыме изотопын келшыше соединенийын чыла изотопшын суммыштлан отношенийжым шотлымо дене ышталтеш. Тиде коэффициент-влак кажне изотоплан процентный значений семын пуалтыт, а лектышым молярный процентный пойдарымаш (МПП) семын ончыктат, кузе ончыч каласыме (42).
Йӱштӧ нейрон пеллетым ий йӱштӧ 80% метанол (v/v) дене гомогенизироватленыт, вихревой йӧн дене 30 минут жапыште -20°C температурышто инкубироватленыт. Образецым уэш пӱтырен, +4°C 30 минут жапыште лугыза. Образецым 21 000 г 5 минут жапыште 4°C центрифугироватлыме, вара лекше супернатант поген да 25°C SpeedVac концентратор дене умбакыже лончылымашлан сушитлыме. Ӱлнӧ ончыктымо семын, сортироватлыме клетке-влакын аминокислоташтлан ЖК-МС анализым эртарыме. TraceFinder (4.2 версий, Thermo Fisher Scientific) дене пайдаланен, данный-влакым кажне соединенийын моноизотопный нелытшым кучылтын лончыленыт. Метаболит данный-влакым квантильный нормализаций preprocessCore программе пакетым кучылтын ыштыме (57).
Лышташым ямдылымаш. Чыве углекислый газ дене вашке наркозым ыштеныт да вуйжым руэныт, вуйдорыкшо вуйдорыкшо гыч вашке луктыныт, а лум дене темыме вибраций пычал дене (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Germany) 300 гыч 375 мкм марте сагиттальный ужашлан шеледеныт да углерод газификаций (29% O25) Тӱшка Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буфер, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 1,0 мМ CaCl2 да 6,0 мМ MgCl2 рН 34 да 30 мО марте келыштарыме). Налме мыйын лаштык-влакым камерыш кусарыза, кушто кугурак Ca2 + ACSF (125,0 мМ NaCl, 2,5 мМ KCl, 1,25 мМ натрий фосфат буфер, 25,0 мМ NaHCO3, 25,0 мМ d-глюкоза, 4,0 мМ Ca2 мМ CaCl да 25,5 ММ 7,4 да 310 гыч 320 мОсм марте). Слайс-влакым 20-30 минут жапыште аралыза, тыге нуным возымо деч ончыч пӧртылташ лиеш.
записи. Чыла возымашлан пеҥгыде возымо камер да 20 пачаш вӱдыш пуртымо объектив (Scientifica) дене пойдарыме микроскоп этапым кучылтмо. Пуркинье клетке-влакым (i) кап кугыт, (ii) анатомический верланымаш да (iii) флуоресцентный mtYFP репортер генын экспрессийже дене палемдыме. гыч 11 мегом марте ӱлыл торешланыше патч-пипеткым боросиликат стекло капилляр (GB150-10, 0,86 мм×1,5 мм×100 мм, Science Products, Hofheim, Germany) да горизонтальный пипетке Instruments (P-1000, Sutter, Sutter, CA) дене луктыт. Чыла возымашым ELC-03XS npi патч-кламп усилитель дене ыштыме (npi электрон GmbH, Tam, Германий), тудым Signal программе дене виктареныт (6.0 версий, Cambridge Electronic, Cambridge, UK). Экспериментым 12,5 кГц дискретизаций писылык дене возен налме. Сигналым кок кӱчык жаплан Бессель фильтр дене фильтроватлат, нунын 1,3 да 10 кГц ӱлыл частотан улыт. Емкость мембране да пипетке компенсироватлымаш схемым кучылтын, усилитель. Чыла экспериментым Orca-Flash 4.0 камера (Hamamatsu, Gerden, Germany) вуйлатыме йымалне эртареныт, тудым Hokawo программе дене виктареныт (2.8 версий, Hamamatsu, Gerden, Germany).
Рутинный пӱтынь клетке конфигураций да анализ. Записи деч ончыч вигак пипеткым кӧргӧ раствор дене темен, тушто тыгай вещества-влак улыт: 4,0 мМ KCl, 2,0 мМ NaCl, 0,2 мМ EGTA, 135,0 мМ калий глюконат, 10,0 мМ Hepes, 4,0 мМ АТФ (05 ММ глюконат), 5 ММ ​​трифаз. (ГТФ) (Na) да 10,0 мМ креатинин фосфат рН 7,25 марте келыштарыме, а осмотический давлений 290 мОсм (сахароза) лийын. Мембраным пудырташ 0 рА вийым кучылтмо деч вара вигак каныш мембранын потенциалжым висыме. Пуртымо торешланымашым -40, -30, -20 да -10 рА гиперполяризованный токым кучылтмо дене висыме. Напряжений вашмут кугытшым висыме да пуртымо торешланымашым шотлаш Ом законым кучылтман. Спонтанный активностьым 5 минут жапыште напряжений зажимыште возен налме, а sPSC-ым Igor Pro-што (32 7.01 версий, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, USA) полуавтоматический палыме скрипт дене палемдыме да висыме. IV криволинейный да стационар ток батарейышке тӱрлӧ потенциал дене (-110 мВ гыч тӱҥалын) пеҥгыдемдыме да 5 мВ ошкыл дене напряженийым кугемдыме дене висыме. АП-ым ыштен лукмашым деполяризаций токым кучылтын тергеныт. Деполяризующий ток импульсым пуымо годым ячейкым -70 мВ дене пеҥгыдемдыза. Кажне возымо блокын ошкыл кугытшым посна келыштарыза (10 гыч 60 pA марте). Эн кугу АП чӱчкыдылыкым лукшо импульсный шпик-влакым кид дене шотлен, эн кугу АП чӱчкыдылыкым шотлыза. АП порогым деполяризаций импульсын кокымшо производныйжым кучылтын лончылат, тудо эн ончыч ик але икмыняр АП-ым тарвата.
Перфорированный патч конфигураций да анализ. Стандарт протокол-влакым кучылтын, перфорированный патч-записьым ыштыза. АТФ- да ГТФ-эрыкан пипеткым кучылтман, тушто тыгай ӱзгар-влак огыт лий: 128 мМ глюконат К, 10 мМ KCl, 10 мМ Hepes, 0,1 мМ EGTA да 2 мМ MgCl2, да pH 7,2 марте келыштарыза (KOH дене пайдаланен). Клетке мембранын контрольдымо проницаемостьшым чараш манын, клетке кӧргысӧ раствор гыч АТФ ден ГТФ-ым луктыт. Патч пипеткым амфотерицин дене кӧргӧ раствор дене (иктаж 200 гыч 250 мкг/мл марте; G4888, Sigma-Aldrich) темдат, тыге перфорироватлыме патч записи лектеш. Амфотерициным диметилсульфоксидыште (пытартыш концентраций: 0,1 гыч 0,3% марте; ДМСО; D8418, Sigma-Aldrich) эрыктеныт. ДМСО-н концентрацийже шымлыме нейрон-влаклан кугу влиянийым ыштен огыл. Перфораций годым каналын торешланымыжым (Ra) эреак эскереныт, да экспериментым Ra ден AP амплитуда пеҥгыдемме деч вара тӱҥалыныт (20-40 минут). Спонтанный активность напряжений да/але ток зажим дене 2 гыч 5 минут марте висыме. Данный-влакым лончылымаш Igor Pro (7.05.2 версий, WaveMetrics, США), Excel (2010 версий, Microsoft Corporation, Редмонд, США) да GraphPad Prism (8.1.2 версий, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) полшымо дене ыштыме. США). Спонтанный АП-влакым палемдаш манын, IgorPro-н NeuroMatic v3.0c плагинже кучылталтеш. Пуымо порогым кучылтын, АП-влакым автоматически палемдаш, тудо кажне записилан посна келыштарыме. Шпик интервалым кучылтын, эн кугу вигак шпик чӱчкыдылык да кокла шпик чӱчкыдылык дене шпик чӱчкыдылыкым рашемдыза.
ПН изолироватлымаш. Ончыч савыкталтше протоколлан келыштарыме дене, ПН-влакым чыве мӱшкыр гыч палемдыме этапыште эрыктеныт (58). Кӱчыкын каласаш гын, изирак вуйдорыкым лум гай йӱштӧ диссоциаций средаште [HBSS Ca2+ да Mg2+ деч посна, 20 мМ глюкоза, пенициллин (50 Е/мл) да стрептомицин (0,05 мг/мл) дене ешарен] луктыныт да луктыныт, вара средам папаин [HBSS, HC-11] дене ешареныт (1 мг / мл), папаин (16 Е / мл) да дезоксирибонуклеаза I (ДНаза I; 0,1 мг/мл)] 30°C температурышто 30 минут жапыште эмлаш. Ончыч ткань-влакым HBSS средаште мушман, тушто ешартыш лышташ (10 мг/мл), BSA (10 мг/мл) да DNase (0,1 мг/мл) уло, ферментный кочкышым кочмо деч аралаш манын, пӧлем температур годым, а вара HBSS средаште, кушто 20 мМ глюкоза уло. (0,05 мг/мл) да ДНКаза (0,1 мг/мл) ик клеткым луктыт. Лӱмын ыштыме клетке суспензийым 70 мкм клетке сито гоч фильтроватленыт, вара клетке-влакым центрифугироватлыме дене (1110 об/мин, 5 минут, 4°C) пеллетироватлыме да сортироватлыме средаште [HBSS, 20 мМ глюкоза дене ешарен, 20% ушкал ӱшкыж дене ешартышым ыштыме ) Сыворотко, пелин (50/50) да стрептомцин (0,05 мг/мл)]; пропидий йодид дене клетке-влакын илышыштым аклаш да клетке-влакын тыгыдылыкыштым 1×106 гыч 2×106 клетке/мл марте келыштараш. Проточный цитометрий деч ончыч суспензийым 50 мкм клетке сито гоч фильтроватленыт.
Проточный цитометр. Клетке-влакым 4°C температурышто FACSAria III машина (BD Biosciences) да FACSDiva программе (BD Biosciences, 8.0.1 версий) дене сортироватлыме. Клетке суспензийым 100 мкм форсунка дене 20 psi давлений дене ~2800 событий/сек писылык дене сортироватлыме. Йӱла шлюз критерий-влак (клетке кугыт, бимодальный ойыркалымаш да шаланыме характеристике) моло клетке тип деч ПН-ым чын ойырен налмашым ӱшандарен огыт керт гын, шлюз стратегий mitoYFP+ ​​да контроль mitoYFP − чыве-влакын YFP интенсивностьыштым да автофлуоресценцийыштым тура таҥастарымаш негызеш шындалтеш. YFP 488 нм лазер линий дене образецым волгалтарыме дене тарвана, а сигналым 530/30 нм полосан фильтр дене палемдат. mitoYFP+ ​​чыве-влакын Rosa26-mitoYFP репортер генын относительный пеҥгыдылыкше тыгак нейрон кап ден аксон фрагмент-влакым ойыраш кучылталтеш. 7-ААД 561 нм кӱшыл лазер дене тарвана да 675/20 нм полосан фильтр дене палемдалтын, колышо клетке-влакым кораҥдаш манын. Астроцит-влакым ик жапыште ойыраш манын, клетке суспензийым ACSA-2-APC дене чиялтеныт, вара образецым 640 нм лазер линий дене волгалтареныт, сигналым пален налашлан 660/20 нм полосан фильтрым кучылтыныт.
Погымо клетке-влакым центрифугироватлыме дене (1110 об/мин, 5 минут, 4°C) пеллетироватлыме да кучылтмо марте -80°C температурышто аралыме. Mfn2cKO чыве ден нунын ӱшкыжышт ик кечыште классифицироватлалтыт, процедурын вашталтышыжым иземдаш манын. FACS данныйым ончыктымаш да анализ FlowJo программе дене ыштыме (FlowJo LLC, Эшленд, Орегон, США).
Ӱлнӧ палемдыме семын (59), умбакыже мтДНК-м шотлымо годым сортироватлыме нейронла гыч ДНК-м ойырен налашлан чын жапыште ПЦР кучылталтеш. Линейность ден пороговый чувствительностьым тӱҥалтышыште тӱрлӧ числан клетке-влак дене qPCR-ым эртарыме дене тергеныт. Кӱчыкын каласаш гын, 300 ПН-ым 50 мМ трис-HCl (рН 8,5), 1 мМ ЭДТА, 0,5% Твин 20 да протеиназа К (200 нг/мл) гыч шогышо лизис буферыште поген, 55°C 120 минут жапыште инкубировать. Клетке-влакым умбакыже 95°C температурышто 10 минут жапыште инкубироватьленыт, тыге протеиназа К-н тичмаш инактивацийжым ышташ лиеш. mt-Nd1-лан ойыртемалтше TaqMan зонд (Thermo Fisher) дене пайдаланен, mtDNA-м 7900HT Real-Time PCR системыште (Thermoherific Scientifics) полуколичественный ПЦР дене висыме. Наука, каталог номер Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Термо Фишер Научный, каталог номер AIVI3E8) да 18S (Термо Фишер Научный, каталог номер Hs99999901_s1) ген-влак.
Протеом образецым ямдылымаш. Растворым 95°C 10 минут жапыште шокшо да ультразвук дене лизис буферыште [6 М гуанидин хлорид, 10 мМ трис(2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид, 10 мМ хлорацетамид да 100 мМ трис- лиз морозильный нейрон пеллет HC]. Биоруптор (Диагенод) ӱмбалне 10 минут (30 секунд пульс / 30 секунд пауза жап). Образецым 1:10 20 мМ трис-HCl (рН 8,0) дене луктыныт, 300 нг трипсин золото (Promega) дене вашталтеныт да 37°C температурышто йӱдым инкубироватленыт, тыге тичмаш кочкышым кочкыныт. Кокымшо кечын образецым 20 000 г 20 минут жапыште центрифугироватлыме. Супернатант 0,1% муравейник кислота дене луктын, а растворым шке ыштыме StageTips дене шӧрым луктыныт. Образецым SpeedVac приборышто (Эппендорф концентратор плюс 5305) 45°C температурышто сушитленыт, вара пептидым 0,1% муравейник кислоташте суспендироватленыт. Чыла образецым ик жапыште ик еҥ ямдылен. Астроцит-влакын образецыштым лончылаш манын, 4 мкг шӧр деч посна пептид-влакым тандем массовый тег дене (TMT10plex, каталог номер 90110, Thermo Fisher Scientific) пептид ден ТМТ реагент коклаште 1:20 отношений дене палемдыме. ТМТ маркироватлымашлан 0,8 мг ТМТ реагентым 70 мкл безводный АСН-ыште угыч шынденыт, а сушилке пептидым 9 мкл 0,1 М ТЭАБ (триэтиламмоний бикарбонат) дене угыч ыштеныт, тушко 7 мкл ТМТ реагентым АСН-ыште ешареныт. Концентраций 43,75% лийын. минут инкубаций деч вара реакцийым 2 мкл 5% гидроксиламин дене йӱлалтеныт. Палемдыме пептид-влакым погеныт, сушитленыт, 200 мкл 0,1% муравейник кислоташте (ФК) угыч шынденыт, кок ужашлан шеледеныт, вара шке ыштыме StageTips дене шӧрым луктыныт. UltiMate 3000 ультра кӱкшӧ лектышан жидкостный хроматографым кучылтын (UltiMate 3000 ультра кӱкшӧ лектышан жидкостный хроматограф), кок пел гыч иктыже 1 мм x 150 мм Acquity хроматографический колонкышто 130Å1.7 мкм C18 частице дене темын (Waters, каталог No SKU: 196366). Термо Фишер Сайентифик). Пептид-влакым 30 мкл/мин йогын дене ойырен налза, 1% гыч 50% марте В буферым 85 минут жапыште 96 минут жапыште ошкыл почеш ошкыл градиент дене ойырыза, 50% гыч 95% марте В буферым 3 минут жапыште, вара 95 % В буферым 8 минут жапыште ойырен налза; А буфер — 5% ACN да 10 мМ аммиак бикарбонат (ABC), а В буфер — 80% ACN да 10 мМ ABC. Кажне 3 минутлан фракций-влакым поген, кок тӱшкалан (1 + 17, 2 + 18 да т.м.) ушен, вакуумный центрифугышто сушитлыман.
ЖК-МС/МС анализ. Масс-спектрометрийлан пептид-влакым (r119.aq номер) 25 см, 75 мкм кӧргӧ диаметран PicoFrit аналитике колонкышто (у объектив линзе, ужаш номер PF7508250) ойыреныт, тудо 1,9 мкм ReproSil-Pur 120 C18-AQD среда дене пойдаралтын (Maischr-AQD), Maischr-YAS. 1200 (Термо Фишер Сайентифик, Германий). Колонкым 50°C температурышто кученыт. А ден В буфер-влак вӱдыштӧ 0,1% муравейник кислота да 80% АСН-ыште 0,1% муравьин кислота улыт. Пептид-влакым 6% гыч 31% марте буфер В гыч 65 минут жапыште да 31% гыч 50% марте буфер В гыч 5 минут жапыште 200 нл/мин градиент дене ойыреныт. Элюироватлыме пептид-влакым Orbitrap Fusion масс-спектрометрыште (Thermo Fisher Scientific) лончыленыт. Пептид прекурсор м/з висымаште 120 000 разрешениян 350 гыч 1500 м/з марте ышталтеш. 27% нормализоватлыме тӱкнымешке энергийым кучылтын, 2 гыч 6 марте заряд состояний дене эн виян прекурсорым кугу энергий С ловушко диссоциаций (HCD) шеледымашлан ойырен налме. Цикл жап 1 слан шындалтын. Пептид фрагментын m/z значенийжым ион лопкаште эн изи AGC цель 5×104 да эн кугу инъекций жап 86 мс дене висыме. Фрагментаций деч вара прекурсорым 45 с жапыште динамике лукмо спискыш вераҥдыме. ТМТ-палемдыме пептид-влакым 50 см, 75 мкм Acclaim PepMap колонкышто (Thermo Fisher Scientific, каталог номер 164942) ойыреныт, а миграций спектр-влакым Orbitrap Lumos Tribrid масс-спектрометрыште (Thermo Fisher Scientific) лончыленыт, тудо кӱкшӧ симметрический толкын дене пойдаралтын (IMS) оборудований (Thermo Fisher Scientific) кок компенсаций напряженийыште пашам ышта −50 да −70 В. MS3 синхронизаций прекурсор негызеш ойырен налме TMT отчет ион сигналым висымаште кучылталтеш. Пептид ойырен налме пашам EASY-nLC 1200 дене эртареныт, 90% линейный градиент элюций дене, 6% гыч 31% марте буферный концентраций дене; буфер А 0,1% FA лийын, а буфер В 0,1% FA да 80% ACN лийын. Аналитике колонко 50°C температурышто пашам ышта. FreeStyle (1.6 версий, Thermo Fisher Scientific) дене пайдаланен, FAIMS компенсаций напряжений почеш оригинальный файлым шеледыза.
Белокым палемдымаш да шотлымо. Интегрироватлыме Andromeda кычалше системым кучылтын, тӱҥ данныйым MaxQuant 1.5.2.8 версий дене лончыленыт (https://maxquant.org/). Aequorea victoria гыч налме Cre рекомбиназа да YFP радам деч посна, пептид фрагмент спектр-влакым чыве эҥертыш протеомын канонический радамжым да изоформный радамжым кычалме (Proteome ID UP000000589, 2017 ий майыште UniProt гыч налме). Метионин окисление да белок N-терминал ацетилирование вашталтшан вашталтыш семын шындалтын; цистеин карбамоил метилирование пеҥгыде вашталтыш семын шындалтын. Пищеварительный параметр-влак «специфичность» да «трипсин/Р» семын шындалтыт. Белокым палемдаш кучылталтше пептид ден бритве пептид-влакын эн изи чотышт 1; шкешотан пептид-влакын эн изи чотышт 0. Пептид картым келыштарыме условийыште белокым палыме лийме чот 0,01 лийын. «Кокымшо пептид» опцийым ыштыме. Тӱрлӧ оригинальный файлым коклаште сеҥымаш дене палыме лиймашым кусарыме годым «йӱк коклаште келшымаш» опцийым кучылтман. LFQ минимум коэффициент шот 1 кучылташ этикетке деч посна количественный (LFQ) (60). LFQ интенсивность кажне жапыште кеч ик генотип тӱшкаште кок чын значенийлан фильтроватлалтеш, да тыглай шеледымаш гыч кумдык дене экстраполироватлалтеш. 0,3 да 1,8 йымалне куснаш. LFQ лектышым лончылаш Perseus вычислительный платформым (https://maxquant.net/perseus/) да R (https://r-project.org/) кучылтман. Дифференциальный экспрессий анализлан limma программе пакет гыч кок могырым кокла t-тестым кучылтмо (61). Шымлыме данный-влакым лончылымаш ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally да pheatmap полшымо дене ышталтеш. ТМТ-негызеш протеомика данныйым MaxQuant 1.6.10.43 версий дене лончыленыт. UniProt-ын айдеме протеомик данный-влак базыж гыч сырьевой протеомик данныйым кычалза, тудым 2018 ий сентябрьыште скачатьленыт. Анализыш производитель пуымо изотоп арулыкым тӧрлымӧ фактор пура. Дифференциальный выраженийым лончылымашлан R-ыште лиммым кучылтман. Тӱҥ данный, данный-влак базым кычалме лектыш, данный-влакым лончылымаш паша радам да лектыш-влак чыланат ProteomeXchange альянсыште PRIDE партнерский репозиторий гоч данный-влак наборын идентификаторжо PXD019690 дене аралалтыт.
Функциональный аннотаций-влак анализым пойдарат. арняште данный-влак наборын функциональный аннотаций термин-влакын поянлыкыштым рашемдашлан Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) ӱзгарым кучылтыныт (1-ше рис). Кӱчыкын каласаш гын, LC-MS/MS (тандем масс-спектрометрий) данныйым лончылымаш гыч налме количественный белок спискым тыгай фильтр критерий дене кучылтыт: Mus musculus вид да фон семын ойырен налме, а категорийыште 0,05 але изирак пойдарымашлан Benjamini дене келыштарыме P значений ончыкталтеш, тудо значенийлан шотлалтеш. Тиде графиклан тӧрлымӧ Р значений негызеш кажне кластерыште эн кӱшыл вич лишыл категорий ончыкталтеш. Шуко t-тест дене пайдаланен, Бенджамини, Кригер да Екутиели (Q = 5%) кок этап линейный нӧлталтше программым кучылтын, кажне категорийыште палемдыме кӱлешан кандидат-влаклан жап дене кылдалтше белок экспрессий анализым ыштат, да кажне радамым посна лончылат. Икгай SD-м налаш огеш кӱл.
Тиде шымлымашын лектышыжым савыкталтше данный-влак базым дене таҥастараш да 1-ше рисыште Венн диаграммым ышташ манын, ме количественный белок спискым MitoCarta 2.0 аннотаций дене ушенна (24). Диаграммым ышташлан Венн диаграммым сӱретлаш (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) онлайн-инструментым кучылтман.
Протеомикым лончылымашлан кучылтмо статистике процедурым лончылымашлан, пожалуйста, Материал ден йӧн-влакын келшыше ужашыштым ончалза. Чыла моло экспериментлан тичмаш информацийым келшыше легендыште муаш лиеш. Вес семын ончыктымо огыл гын, чыла данныйым кокла шот ± SEM семын ончыктымо, да чыла статистике анализ-влакым GraphPad Prism 8.1.2 программе полшымо дене ыштыме.
Тиде статьялан ешартыш материалым http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1 сайтыште муаш лиеш
Тиде почылтшо статья, тудо Creative Commons Attribution-Non-Commercial License условий почеш шарлен, тудо кеч-могай йӧн дене кучылташ, шаркалаш да ешарен лукташ йӧным пуа, пытартыш кучылтмаш коммерческий пайдалан огыл гын да тӱҥ паша чын улмылан негыз уло гын. Ссылки.
Палемдыман: Ме тендан деч электрон почто адресым пуаш гына йодына, тыге еҥ, кудым тый лаштыкыш темлет, пала, мом те нунылан электрон почто ужаш шонеда да тиде спам огыл. Ме нимогай электрон почто адресым огына нал.
Тиде йодыш тендан унагудо улмыдам тергаш да автоматический спам колтымо деч аралаш кучылталтеш.
Э. Мотори, И. Атанасов, С. В. Кочан, К. Фольц-Донахуэ, В. Сактивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Дж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Дисфункциональный нейрон-влакым протеомический анализ ончыктен: нейродегенераций ваштареш кучедалаш метаболический программе-влак тарванат.
Э. Мотори, И. Атанасов, С. В. Кочан, К. Фольц-Донахуэ, В. Сактивелу, П. Джавалиско, Н. Тони, Дж. Пуял, Н.-Г. Ларсон
Дисфункциональный нейрон-влакым протеомический анализ ончыктен: нейродегенераций ваштареш кучедалаш метаболический программе-влак тарванат.
©2020 Наукым вияҥдыме шотышто американ ассоциаций. чыла правам аралыме. AAAS — HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef да COUNTER-ын партнерышт. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.